實驗材料及試劑

96 孔板,、CO2培養(yǎng)箱,、酒精燈,、移液***,、酶標儀等,；細胞,、CCK8等,。

實驗內(nèi)容取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細胞,，每孔按 4×103個接種至 96 孔板中,，每組設(shè)置8個復(fù)孔,，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后,。繼續(xù)培養(yǎng) 48h 后,，棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的含 10ｕL的毒性檢測液CCK8,，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后,，用酶標儀測波長為450 nm的OD值。實驗重復(fù) 3 次,， 取實驗結(jié)果的平均值作為**終實驗結(jié)果,。按公式計算生長***率＝[(對照組 OD－實驗組 OD)/對照組 OD]  ×**，以分組為橫坐標,，生長***率為縱坐標,，繪制細胞生長***率柱狀圖。 在CCK-8試劑盒中,，**主要的化學(xué)藥品是WST-8.湖北cck8細胞增殖實驗原理

CCK8的優(yōu)點：方法方便,，不用洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑,；CCK-8快速檢測,；CCK-8檢測靈敏度高，細胞密度低也可以檢測,；CCK-8的重復(fù)性優(yōu)于MTT法,；CCK-8對細胞的毒性很小,；CCK-8細胞活性檢測試劑中是1瓶溶液,，不需要現(xiàn)用現(xiàn)配，即開即用,。CCK8的缺點：相比于與MTT法,，CCK8的價格比較昂貴生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比,。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。用途：***篩選,、細胞增殖測定,、細胞毒性測定、**藥敏試驗,。天津同仁 cck8細胞增殖測定：細胞增殖實驗在很多領(lǐng)域都會用到,，比如**相關(guān)、損傷后修復(fù)等,。

細胞活性檢測1.在96孔板中接種細胞懸液(100ml/孔),。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)(在37℃，5%CO2的條件下),。2.向每孔加入10ml的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,，它們會影響O.D值的讀數(shù))。3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時,。4.用酶標儀測定在450nm處的吸光度,。5.如果暫時不測定O.D值，打算以后測定的話,，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液,，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化,。細胞增殖-毒性檢測1.在96孔板中配制100ml的細胞懸液,。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(在37℃，5%CO2的條件下),。

培養(yǎng)基對CCK8測定的影響：不同的培養(yǎng)基中含有氧化還原性物質(zhì)不同,，（主要是氨基酸的成分及糖含量），會與CCK8發(fā)生反應(yīng),，產(chǎn)生實驗誤差,，因此所用培養(yǎng)基要一致,，不要更換其他培養(yǎng)基,。比如DMEM空白吸收為0.93；1640培養(yǎng)基在0.5左右,。另外培養(yǎng)基中有酚紅存在的情況下,，會增加空白吸收，但不影響測定,，扣除空白吸收即可,，可見空白孔非常重要，所以每次實驗均要設(shè)定空白對照,。另外,，血清不影響測定。有師妹在做一個HIF1a***劑實驗時，多加了這個***劑的濃度,，水溶性,，不需要換液，尤其適合于懸浮細胞.

統(tǒng)一鋪好后,，待細胞完全沉淀下來后,，在顯微鏡下觀察各實驗組的細胞密度，如果密度不均勻,，則固定一組,，微調(diào)其他組細胞的量再次鋪板（如：發(fā)現(xiàn)NC組細胞較多，降低細胞量再次鋪板）,，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。4.從鋪板后第二天開始，每孔加入10-20μlCCK-8溶液,，如果每孔的培養(yǎng)基為100μl,，則加入10μlCCK-8溶液，如果每孔的培養(yǎng)基為200μl,，則加入20μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡,，它們會影響OD值的讀數(shù)）。用加了相應(yīng)量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照,。靈敏度高,，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好.天津cck8細胞增殖實驗步驟

若細胞培養(yǎng)時間較長,，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化,，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8.湖北cck8細胞增殖實驗原理

五、實驗注意事項：·若暫時不測定OD值,，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液,，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定,，吸光度不會發(fā)生變化,。·如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基,，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次,，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響,。當(dāng)然***影響比較小的情況下,，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可,。·當(dāng)使用標準96孔板時,，貼壁細胞的**小接種量至少為1,000個/孔(100μl培養(yǎng)基),。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔(100μl培養(yǎng)基),。湖北cck8細胞增殖實驗原理