3,、24小時(shí)后,，吸出培養(yǎng)基,，對(duì)照組和空白組每孔各加入100ul無血清培養(yǎng)基,，實(shí)驗(yàn)組每孔加入100ul基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的***,，繼續(xù)作用12或24小時(shí),；4,、***作用完畢后,，每孔加入50ulMTT,繼續(xù)作用4小時(shí),；5,、棄掉每孔中的MTT，每孔加入150ul的DMSO或異丙醇,。然后震蕩10分鐘,，使孔底的紫色結(jié)晶充分溶解；6,、在酶聯(lián)免疫機(jī)器上測(cè)定吸光度,，波長為550nm或490nm,。7、細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/(對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值)***,。**藥敏試驗(yàn)：這個(gè)是用的比較廣的,，我見過做**的團(tuán)隊(duì)，買CCK-8都是一整箱,，一整箱的買,。江蘇cck8數(shù)值

四、方法及步驟：實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析1,、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù),。2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約1-2×104）,，每孔約100ul細(xì)胞懸液,，同樣的樣本可做4-6個(gè)重復(fù)。3,、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時(shí),，如果不需要貼壁，這步可以省去,。4,、加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,，建議將***頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻,。或者直接配置含10%CCK8的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配）,，以換液的形式加入,。江蘇cck8數(shù)值用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長處測(cè)定其光吸收值.

貼壁生長的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長24h了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全,，而且這樣設(shè)置時(shí)間對(duì)自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便,。沒人愿意大半夜爬起來做實(shí)驗(yàn)吧。3,、加藥后的孵育時(shí)間,，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個(gè)時(shí)間，24h,，48h,，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）,、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇比較好的時(shí)間,。太長了就沒有必要了，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。4,、CCK8試劑加入量,，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個(gè)問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系,，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢,，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢,。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致,。本人**終采用的是后者。

切記一定要使用無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,，一是可以排除血清對(duì)細(xì)胞生長的影響,；二是血清的存在會(huì)對(duì)吸光度的測(cè)量產(chǎn)生影響。以上是MTT比色法的介紹,，MTT比色法因?yàn)樯婕暗轿雠囵B(yǎng)基溶解沉淀的操作,，所以更適用于貼壁細(xì)胞,，懸浮細(xì)胞比較好選用CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖,，下面給大家介紹一下CCK8操作的注意事項(xiàng)。CCK8實(shí)驗(yàn)操作CCK8的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)細(xì)胞沒有毒性,，可以直接加入細(xì)胞中長時(shí)間孵育,，而不用考慮試劑本身對(duì)細(xì)胞帶來的影響。向各孔中加入10ul的CCK-8檢測(cè)溶液,。如若檢測(cè)的細(xì)胞增殖或毒性試驗(yàn),，需在此之前加入作用***培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，例如6h/12h/24h等,，然后再加入CCK8檢測(cè)液,。培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā)，為減少誤差,，建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基,。

實(shí)驗(yàn)原理：CellCountingKit-8（簡(jiǎn)稱CCK-8）試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）,。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析,。CCK8的實(shí)驗(yàn)步驟,、實(shí)驗(yàn)分組及檢測(cè)方法.上海cck8細(xì)胞

若細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化,，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8.江蘇cck8數(shù)值

,。一般情況下，**外一圈的孔只加培養(yǎng)基,，不作為測(cè)定孔用,。在培養(yǎng)基中加入CCK8,，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照,。在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí),，還應(yīng)考慮***的吸收，可在加入***的培養(yǎng)基中加入CCK8,，培養(yǎng)一定的時(shí)間,，測(cè)定450 nm的吸光度作為空白對(duì)照。金屬對(duì)CCK-8顯色有影響：當(dāng)終濃度為1mM的氯化亞鉛,、氯化鐵,、硫酸銅會(huì)***5%、15%,、90%的顯色反應(yīng),，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 mM的話,，將會(huì)*****,。懸浮細(xì)胞由于染色比較困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間,。江蘇cck8數(shù)值