讀數(shù)前可在搖床上溫柔混勻，酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度。

***率（％）= [（對(duì)照孔吸光度-實(shí)驗(yàn)孔吸光度）/（對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度）]×100=IC50

注意事項(xiàng)

CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況基于的原理是脫氫酶催化的反應(yīng),，如果實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件中存在還原劑的影響,，應(yīng)事先去除。如果實(shí)驗(yàn)條件中存在還原物質(zhì),，需單獨(dú)測(cè)定還原物質(zhì)的空白吸光度。如果還原物質(zhì)的吸光度很小，可以忽略不計(jì),；但如果吸光度很大，則需要去除培養(yǎng)基,，再用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次,，然后再加入新的 100ul培養(yǎng)基和10ul CCK-8 溶液進(jìn)行檢測(cè)。 水溶性,，不需要換液,，尤其適合于懸浮細(xì)胞.北京cck8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)過程

當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的**小接種量至少為1000 個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基),。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低,，因此推薦接種量不低于2500 個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。酚紅和血清對(duì)CCK8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾,，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,。

注意事項(xiàng)CCK8可以檢測(cè)大腸桿菌，但不能檢測(cè)酵母細(xì)胞,。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測(cè)定的過程中需要避免細(xì)菌污染,，以免影響結(jié)果。CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個(gè)月,，在-20℃下避光可以保存1年,。當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí),，培養(yǎng)板**外一圈的孔**容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差,。一般情況下,，**外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測(cè)定孔用,。在培養(yǎng)基中加入CCK8,，培養(yǎng)一定的時(shí)間，測(cè)定450 nm的吸光度即為空白對(duì)照,。 北京cck8英文說明書代謝率低了以后,，細(xì)胞呼吸減弱，NAD+產(chǎn)生減少,，測(cè)出的Formazan也會(huì)減少,。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)就是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定，常用的方法有MTT,、CCK8以及流式檢測(cè),。閱讀大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，如果想證明一個(gè)***或者說是一個(gè)作用條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,，基本上大家都采用MTT或CCK8結(jié)合流式的雙標(biāo)準(zhǔn)來證明作用效果,。所以，***先給大家介紹一下MTT和CCK8比色法的實(shí)驗(yàn)操作和注意事項(xiàng),。

MTT實(shí)驗(yàn)操作

1,、在96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組（細(xì)胞+無血清培養(yǎng)基）,、實(shí)驗(yàn)組和空白組（無血清培養(yǎng)基）,，可以采用如下圖的排版方式：

2、在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中,，每孔加入細(xì)胞懸液100ul,培養(yǎng)24小時(shí),；

貼壁生長(zhǎng)的時(shí)間我一般就直接讓它貼壁長(zhǎng)24h了，這個(gè)時(shí)間細(xì)胞已經(jīng)貼壁完全,，而且這樣設(shè)置時(shí)間對(duì)自己安排實(shí)驗(yàn)時(shí)間也方便,。沒人愿意大半夜爬起來做實(shí)驗(yàn)吧。3,、加藥后的孵育時(shí)間,，我的實(shí)驗(yàn)摸了3個(gè)時(shí)間，24h,，48h,，72h。然后根據(jù)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性（RSD）、OD值的范圍（1.0左右）這些來選擇比較好的時(shí)間,。太長(zhǎng)了就沒有必要了,，細(xì)胞呆在孔里幾天不換液結(jié)果可想而知了。4,、CCK8試劑加入量,，說明書中明確寫出建議加入量為培養(yǎng)基體積的10%。這里有一個(gè)問題：假設(shè)我要孔內(nèi)是200微升的體系,，即細(xì)胞懸液+藥液+CCK8=200微升呢,，還是細(xì)胞懸液+藥液=200微升，cck8不算在體系內(nèi)呢,。關(guān)于這一點(diǎn)文獻(xiàn)報(bào)道不一致,。本人**終采用的是后者。5,、cck8試劑加入后孵育時(shí)間,，隨著時(shí)間的增加，OD值就會(huì)增大,?？傊瓌t就是把OD值控制在1.0左右。這里我考察了0.5h,、1.0h、2.0h,。在CCK-8試劑盒中,，**主要的化學(xué)藥品是WST-8.

CCK-8的原理

所以粗略的可以認(rèn)為生成的甲瓚物的顏色的深淺與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。為什么是粗略的呢,，因?yàn)檫@里沒有考慮到細(xì)胞代謝水平的高低,，有些細(xì)胞在***處理后，可能活細(xì)胞數(shù)不變,，但是代謝率低了以后,，細(xì)胞呼吸減弱，NAD+產(chǎn)生減少,，測(cè)出的Formazan也會(huì)減少,，所以此時(shí)怎么算呢（此時(shí)我就比較懷戀中性紅了）？當(dāng)然也有解決的辦法,，下期給大家介紹,。因此可利用這個(gè)原理進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析，在吸光度為450時(shí)檢測(cè)讀數(shù),。顏色也會(huì)越深 請(qǐng)問合適的種板數(shù)是怎么定義的呢?北京cck8吸光度范圍

CCK-8試劑中含有WST–8.北京cck8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)材料及試劑

96 孔板,、CO2培養(yǎng)箱、酒精燈、移液***,、酶標(biāo)儀等,；細(xì)胞、CCK8等,。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,，每孔按 4×103個(gè)接種至 96 孔板中，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔,，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，待細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后。繼續(xù)培養(yǎng) 48h 后,，棄含藥培養(yǎng)基,，每孔加入新鮮配制的含 10ｕL的毒性檢測(cè)液CCK8，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4h 后,，用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的OD值,。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次， 取實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值作為**終實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。按公式計(jì)算生長(zhǎng)***率＝[(對(duì)照組 OD－實(shí)驗(yàn)組 OD)/對(duì)照組 OD]  ×**,，以分組為橫坐標(biāo)，生長(zhǎng)***率為縱坐標(biāo),，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)***率柱狀圖,。 北京cck8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)過程