細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.試劑過期有時候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況,。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解,。較后發(fā)現(xiàn),，原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后,，立馬成功,。根據(jù)我的經(jīng)驗，盡量使用開封半年內(nèi)的,，因為過了半年后,，就算沒有過失效期，但是細(xì)胞毒性較大增加,，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降,。千萬不要為了省錢，影響實驗進(jìn)度哈,。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時加入血清,，會導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基,。根據(jù)毛博的經(jīng)驗,，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個時候,，較好不要換液,，不要打擾細(xì)胞，讓它安安靜靜地休息,。但是也不能過早加入血清,。過早的話，會引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長,。那么,，什么是較佳時機呢？在20%的細(xì)胞變圓的時候,，就是加血清的較佳時機,。瞬時和穩(wěn)定表達(dá)DNA轉(zhuǎn)染后，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)可以在1－4天內(nèi)檢測到,。珠海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗的方法有哪些：1..電穿孔法,。通過短暫的高電場電脈沖處理細(xì)胞，沿細(xì)胞膜的電壓差異會導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時穿孔,。DNA被認(rèn)為是穿過孔擴散到細(xì)胞內(nèi)的,。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞,。理論上說電穿孔法可用于各種細(xì)胞,，且不需要另外采購特殊試劑,，但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA,，因為細(xì)胞的死亡率高。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化,。2.細(xì)菌介導(dǎo)的傳染,。傳染需要將目的基因克隆到特定的細(xì)菌體系中，經(jīng)過包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的細(xì)菌,，再進(jìn)行傳染,。優(yōu)點是轉(zhuǎn)染效率特別高，尤其是難以轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞,、細(xì)胞,。缺點是構(gòu)建細(xì)菌周期長，環(huán)節(jié)多,，易出錯,，費用也高。太原細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家批發(fā)價較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對數(shù)生長期的細(xì)胞,。

影響轉(zhuǎn)染試驗的因素：細(xì)胞狀態(tài)變化：（1）轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞不匹配細(xì)胞轉(zhuǎn)染較適合的不是原代細(xì)胞,，也不是傳代很多次的細(xì)胞。這是因為細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。較適合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到對數(shù)生長期的細(xì)胞,，細(xì)胞生長旺盛,，較容易轉(zhuǎn)染。（2）把握時機沒錯,！轉(zhuǎn)染也有適當(dāng)?shù)臅r機,，相比較非分裂細(xì)胞——分裂細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此對大多數(shù)轉(zhuǎn)染操作而言,，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前現(xiàn)在種板,。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài)，如細(xì)胞數(shù)量過多,，互相疊加,，營養(yǎng)物質(zhì)耗竭，代謝廢物積聚,，轉(zhuǎn)染率低下也是很正常的,！

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選：生長的細(xì)胞比不分裂的細(xì)胞更快的受到GENETICIN物品的影響。轉(zhuǎn)染后,，在開始篩選前等待48-72小時,，使細(xì)胞表達(dá)足夠量的抗性酶,，保證在開始篩選時可以自我保護(hù)。轉(zhuǎn)染后48-72小時倒掉培養(yǎng)基,，加入含有GENETICIN物品的培養(yǎng)基,，物品的濃度根據(jù)劑量反應(yīng)曲線確定，足夠殺死未轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。因為許多因子影響到篩選所需的GENETICIN物品的較佳濃度,，包括細(xì)胞類型，培養(yǎng)基和血清濃度等,，所以有必要對每種細(xì)胞作一個劑量反應(yīng)曲線,，確定較佳濃度。篩選較多可能需要一周時間,，因為在致死劑量的GENETICIN物品存在條件下,，細(xì)胞會分裂1-2次。在次培養(yǎng)細(xì)胞時使用較低劑量的物品,，一般是篩選劑量的一半,。篩選后的細(xì)胞一般是離散的克隆，根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?，可以分別純化（克?。占M(jìn)行大量培養(yǎng)或染色并進(jìn)行抗性克隆的計數(shù),。加入混合液,，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染,，你至少要掌握以下幾點：主要有下面幾種方法：：化學(xué)法：磷酸鈣法,、DEAE-右旋糖苷法、陽離子脂質(zhì)體法,；物理法：電穿孔法,、顯微注射法、顆粒傳遞法,；細(xì)菌介導(dǎo)法：逆轉(zhuǎn)錄細(xì)菌,、腺細(xì)菌A.陽離子脂質(zhì)體法：帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。特點：簡單通用,，適用性廣,，轉(zhuǎn)染效率高，重復(fù)性好,，但轉(zhuǎn)染時需除血清,，轉(zhuǎn)染效率隨細(xì)胞類型變化大。由于脂質(zhì)體復(fù)合物與貼壁細(xì)胞的接觸機會遠(yuǎn)大于懸浮細(xì)胞，所以貼壁比懸浮轉(zhuǎn)染效率要高,。懸浮細(xì)胞建議使用電穿孔法,。B.電穿孔法：利用高壓電脈沖對細(xì)胞膜的干擾，使其形成利于核酸進(jìn)入的微孔,。蛋白表達(dá)和培養(yǎng)基的選擇哺乳動物細(xì)胞系合成可溶的,。鄭州細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染,、轉(zhuǎn)導(dǎo)幾個名詞是從事生命科學(xué)研究的初學(xué)者經(jīng)常碰到的,。珠海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟：1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩,。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基,。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩,。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘,。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次,。5.加入混合液,，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。6.到時后,，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時~珠海細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑銷售廠家

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