原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作步驟（以24孔培養(yǎng)板為例）：A.細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種細(xì)胞,，每孔500μl培養(yǎng)基（不可加物品），使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)密度在30-50%,。B.siRNA-RFectPM混合物準(zhǔn)備：1.6pmolsiRNA用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋,。2.2μlRFectPM用50μl無血清培養(yǎng)基稀釋。輕輕混勻,，室溫孵育5min,。注意：確保在25min內(nèi)執(zhí)行第三步操作，不要過于延遲,。3.孵育5min后,，將siRNA稀釋液與RFectPM稀釋液混合（總體積100μl）。輕輕混勻,，室溫孵育20min,。C.將混合物加到培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)）：1.將100μl混合物加入培養(yǎng)孔內(nèi)，培養(yǎng)孔內(nèi)含有0.5ml培養(yǎng)的細(xì)胞,。輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板,，混勻。2.37°C培養(yǎng)18-72h,，檢測(cè)基因克制效果,。如果需要，細(xì)胞培養(yǎng)4-6h時(shí)可以更換培養(yǎng)基,，但不是必須,。孵育時(shí)間的長短，取決于細(xì)胞類型,、所干擾基因本身及分析方法,。可設(shè)置不同的孵育時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定較佳孵育時(shí)間,。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)優(yōu)化:為了提高轉(zhuǎn)染效率,，較好對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化，特別是開始使用,。細(xì)胞適應(yīng)體外環(huán)境后進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)再以較低的密度接種和培養(yǎng),。金華南昌原代細(xì)胞分離試劑盒

這種有限的分裂能力體內(nèi)的細(xì)胞相似，一旦細(xì)胞在體內(nèi)完全分化以發(fā)揮其特殊功能,，細(xì)胞將停止增殖-這是固有的保護(hù)性衰老過程,。此外，某些原代細(xì)胞有絲分裂后,，無論是在體內(nèi)或體外培養(yǎng)中都不增殖（例如,，神經(jīng)元，骨骼肌細(xì)胞,，心肌細(xì)胞,，周細(xì)胞，終末分化的肝細(xì)胞）,。因此,，每次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后，原代細(xì)胞培養(yǎng)都需要再次從新鮮的組織中解離,。原代細(xì)胞應(yīng)用困局：經(jīng)過一次傳代后,，原代細(xì)胞培養(yǎng)物就會(huì)成為二級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物，也稱為細(xì)胞株,。然而,，盡管稱為細(xì)胞株,，但其壽命是有限的（除非如前所述永生化）。昆明原代細(xì)胞分離試劑盒直銷廠家貼壁細(xì)胞多來自部位組織,，而懸浮細(xì)胞多來自血液系統(tǒng)的細(xì)胞,。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)和維持：(1)原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的開始培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的靠前步,，是一項(xiàng)基本技術(shù),。原代細(xì)胞較接近和較能反映體內(nèi)生長特性，適宜用于藥物敏感性試驗(yàn),、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究,。①組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法,。其基本方法是將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶(或皿)中,，瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層，以利于組織塊粘著于瓶壁,，使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長,。

原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和部位后立即進(jìn)行培養(yǎng),。因此,，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì),，如果是正常細(xì)胞,，仍然保留二倍體數(shù)。原代細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中,，也可能產(chǎn)生基因突變而形成無限傳代的細(xì)胞株,，傳代次數(shù)越多，就越有可能變成細(xì)胞株（基因缺陷型）,，因此科學(xué)界也通常把靠前代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng),。較常用的原代細(xì)胞的培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上,，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)很適合用于藥物測(cè)試,、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。

原代細(xì)胞的獲?。好赶ǎ核迷噭耗z原酶和胰酶,。膠原酶的配制：建議看相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進(jìn)行配制,，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）,。胰酶（酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會(huì)加入胰酶，相關(guān)文章也蠻多的）膠原酶消化時(shí)間：根據(jù)組織特性,，消化時(shí)間會(huì)有差異,。以小鼠腎細(xì)胞為例,，加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,，期間每10min中震蕩一次,，知道組織塊幾乎完全消失為止（若是組織塊剪得非常細(xì)小,，時(shí)間可以短一些,，30min左右即可）。原代細(xì)胞作為更接近體內(nèi)環(huán)境的研究模型,。金華原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商

盡快使接種的細(xì)胞貼壁,，是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。金華南昌原代細(xì)胞分離試劑盒

原代細(xì)胞與細(xì)胞系該如何選：原代細(xì)胞生長緩慢,，一般認(rèn)為,，原代細(xì)胞培養(yǎng)的第1代和傳代到第10代以內(nèi)統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不容易傳下去了,，細(xì)胞的生長會(huì)出現(xiàn)停滯,，大部分細(xì)胞衰老死亡。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過“危機(jī)”而繼續(xù)傳下去,，這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40-50代,，這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株。當(dāng)細(xì)胞傳至50代以后又會(huì)出現(xiàn)“危機(jī)”,，這時(shí)有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變且?guī)в凶兊奶攸c(diǎn),，從而可能無限制地傳代下去，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系,。金華南昌原代細(xì)胞分離試劑盒