原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：原代細(xì)胞是出了名的難養(yǎng),，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)操作的要求更苛刻。原代細(xì)胞在體外通常只能傳代少數(shù)幾次,，某些原代細(xì)胞（如神經(jīng)元細(xì)胞）甚至無(wú)法進(jìn)行傳代,。對(duì)于研究人員來(lái)說(shuō)，如何才能經(jīng)濟(jì)高效地培養(yǎng)好原代細(xì)胞,，并圍繞這有限幾次傳代的細(xì)胞設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),，是更大的一個(gè)挑戰(zhàn)。原代細(xì)胞是取材于切除的動(dòng)物組織,，通過(guò)酶處理,，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)直至達(dá)到足夠的數(shù)量。分離的原代細(xì)胞有兩種類型：貼壁細(xì)胞（錨定依賴性生長(zhǎng)）和懸浮細(xì)胞（錨定非依賴性）,，貼壁細(xì)胞多來(lái)自部位組織,，而懸浮細(xì)胞多來(lái)自血液系統(tǒng)的細(xì)胞。相關(guān)研究工作已經(jīng)揭示了生長(zhǎng)培養(yǎng)基必須包含的基本成分,。鄭州原代細(xì)胞分離試劑盒廠家批發(fā)價(jià)

原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：轉(zhuǎn)染過(guò)程不可添加物品,，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；開始實(shí)驗(yàn)siRNA的用量設(shè)置在終濃度10nM,、30nM,、50nM、100nM進(jìn)行摸索,，后續(xù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果修改,。RFectPM可用來(lái)轉(zhuǎn)染siRNA、antisenseRNA,、microRNA等200bp以內(nèi)的小分子RNA和DNA,，可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞。對(duì)于大多數(shù)原代細(xì)胞,，RFectPM的細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率都在80%以上,，而轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也極其簡(jiǎn)便,，先將sRNA與RFectPM室溫混合,，再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養(yǎng)基的細(xì)胞，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效果沒(méi)有影響,，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液,。合肥長(zhǎng)沙原代細(xì)胞分離試劑盒應(yīng)該添加額外的組織特異性因子，以防止成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng),。

膠原酶的配制：建議看相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行膠原酶的配制,。小編常用的是DMEM進(jìn)行配制，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）,。胰酶（酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會(huì)加入胰酶,，相關(guān)文章也蠻多的）膠原酶消化時(shí)間：根據(jù)組織特性,，消化時(shí)間會(huì)有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例,，加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后,，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右，期間每10min中震蕩一次,，知道組織塊幾乎完全消失為止（若是組織塊剪得非常細(xì)小,，時(shí)間可以短一些，30min左右即可）,。原代細(xì)胞的獲?。好赶ǎ核迷噭耗z原酶和胰酶

懸浮型原代細(xì)胞：1）必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)?？梢酝ㄟ^(guò)增加培養(yǎng)液的黏度來(lái)幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài),，如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是,，以5ml為較低限度，否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害,。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快,，否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下,，可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞2）能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，其生命力一般都比較旺盛,，體外分裂增殖的速度較快,，營(yíng)養(yǎng)成分消耗大，換液時(shí)間隔一般較短,。用專門的原代細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),，較大限度提高原代細(xì)胞的生長(zhǎng)。

使用RFect系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞接種：一般做轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml）,，使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%,；如果細(xì)胞是原代細(xì)胞，接種密度可以密一些,，細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml,；懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板（細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml），待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%,。2.為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果,，靠前次使用建議您用24孔板做，每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可,。將較佳轉(zhuǎn)染條件（siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量,、比例）放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng),，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)。天津原代細(xì)胞分離試劑盒直銷廠家

從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù),。鄭州原代細(xì)胞分離試劑盒廠家批發(fā)價(jià)

原代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)步驟為：1）將動(dòng)物組織從機(jī)體中取出并消毒除去存留在組織上的細(xì)菌,、細(xì)菌、等污染源,，這些污染源將會(huì)所需培養(yǎng)的原代細(xì)胞凋亡,、停止生長(zhǎng)和繁殖直至死亡，因此整個(gè)原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中較全在無(wú)菌狀態(tài)下進(jìn)行,。2）將組織塊在選定的蛋白酶溶液中浸泡20-30分鐘,，通常在37C水浴里進(jìn)行，而蛋白酶的選定取決于部位組織和所需細(xì)胞的類型,，比如成骨,、肌肉、心,、肝等就需要用胰蛋白酶才能解而出單個(gè)細(xì)胞,，但是對(duì)于腦組織和乳腺等軟組織，就只能用分解能力較弱的膠原蛋白酶,，以免損傷分散出來(lái)的單個(gè)細(xì)胞,。3）將分散而成的單個(gè)細(xì)胞置于合適的培養(yǎng)基（含有特殊細(xì)胞生長(zhǎng)因子、添加劑以及血清,，或者無(wú)血清培養(yǎng)基）中培養(yǎng),，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖,，整個(gè)過(guò)程都是在無(wú)菌情況下操作鄭州原代細(xì)胞分離試劑盒廠家批發(fā)價(jià)