如何高效率實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染：DNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細胞胞漿內(nèi)的DNA不能穿過細胞核的核膜（"核屏障"）。在細胞有絲分裂過程中核膜溶解,，DNA進入細胞核才有可能,。為此，細胞處于分裂期對DNA轉(zhuǎn)染是至關(guān)重要的,，并且處于分裂期的細胞比例必須盡可能大才能實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染,。DNA轉(zhuǎn)染機制示意圖如下所示：轉(zhuǎn)染RNA(siRNA/miRNA/mRNA)對于RNA轉(zhuǎn)染是沒有"核屏障"的，因為RNA不需要進入細胞核發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng),，因此細胞分裂對它沒有影響,。轉(zhuǎn)染試劑的選擇理想的轉(zhuǎn)染試劑選擇可以使您的實驗如虎添翼！真核細胞的先天免疫系統(tǒng),，使它們能夠檢測外來物質(zhì)如脂多糖,、細菌或細菌核酸和蛋白質(zhì)，并克制潛在病原體的入侵。此外,，細胞通過信使分子向臨近細胞傳遞發(fā)現(xiàn)有害物質(zhì)的信號,。因此，這些臨近細胞甚至無需接觸病原體即可采取防御方式,。這種細胞先天免疫系統(tǒng)也是轉(zhuǎn)染成功的一個障礙,。有血清時的轉(zhuǎn)染 血清一度曾被認為會降低轉(zhuǎn)染效率。成都細胞高效轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商

轉(zhuǎn)染的注意事項：培養(yǎng)基中的物品物品,，比如青霉素和鏈霉素,，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性,，使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品,，甚至在準備轉(zhuǎn)染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品,。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細胞,。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑,。另外,，為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量,。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,，原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,，這會導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,，融化一管新鮮的細胞可能會恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性,。比如，新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率,，融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。因此,，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復(fù)較佳結(jié)果。蘇州正規(guī)細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家現(xiàn)貨蛋白表達和培養(yǎng)基的選擇哺乳動物細胞系合成可溶的。

細胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個大坑：1.準備不足做脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的時候,，在開展正式實驗前要多做預(yù)試驗,，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件包括：脂質(zhì)體的用量,、DNA密度,、細胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時間等等,。2.電壓過大做電轉(zhuǎn)的時候,，如果電壓太大，往往會發(fā)生細胞大量死亡的情況,。不同的細胞,，需要的電壓是不一樣的。這就要求我們多做預(yù)實驗,，多摸索條件,。對于大多數(shù)細胞來說，其較佳電壓位于250-1250v/cm,。另外,，就是進行轉(zhuǎn)染的細胞應(yīng)該處于對數(shù)生長期。處于對數(shù)生長期的細胞的抗損傷能力是較強的,。細胞濃度應(yīng)該處于5x106到1x107／mL之間,。每次轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒應(yīng)該控制在4-6μg，如果﹥10μg,，轉(zhuǎn)染效率也較大降低,。電擊后，應(yīng)該將DNA和細胞混合液在室溫下放置10分鐘,，使細胞恢復(fù)損傷,。

瞬時轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的監(jiān)測：基因的瞬時表達在24-72小時內(nèi)就結(jié)束了。這種快速的瞬時表達非常適用于驗證質(zhì)粒表達和監(jiān)測轉(zhuǎn)染步驟的效率,?？梢允褂脠蟾婊騺泶_定優(yōu)化條件，其表達蛋白易檢測,，在目的細胞中不含此蛋白或水平很低,。常用的報告基因包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT），綠色熒光蛋白（GFP）,，熒光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）,。可以使用簡單的非同位素方法檢測b-gal的表達以測定轉(zhuǎn)染效率和活性,。pCMVSPORT-bgal質(zhì)粒包含CMV啟動子調(diào)控下的LacZ基因,，轉(zhuǎn)染入真核細胞內(nèi)后可以直接表達bgal,。結(jié)合簡單的檢測步驟，可以做為監(jiān)測轉(zhuǎn)染條件的一種方便靈敏的方法細胞轉(zhuǎn)染是完成這一過程的必需步驟,。

細胞轉(zhuǎn)染常用步驟：1.轉(zhuǎn)染試劑的準備①將400ul去核酸酶水加入管中,，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物,。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存,，使用前還需震蕩。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞,。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基,。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩,。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次,。5.加入混合液，將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時,。6.到時后,，根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時,。瞬時表達分析檢測未重組質(zhì)粒DNA上基因的表達,。貴陽細胞高效轉(zhuǎn)染試劑廠家直銷

脂質(zhì)體可以和帶負電荷的核酸結(jié)合后重新形成復(fù)合物。成都細胞高效轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商

細胞轉(zhuǎn)染的常用方法：磷酸鈣共沉淀原理：該法可用于瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,。然而因其對pH,、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感，所得結(jié)果容易出現(xiàn)差異,，且對許多類型的細胞培養(yǎng)物(尤其是原代細胞)具有細胞毒性,，轉(zhuǎn)染效率較差。實驗步驟：將核酸與氯化鈣在磷酸鹽緩沖液中混合,，同時控制好pH,、溫度等條件→室溫孵育，生成濃縮DNA的極小不溶性顆粒沉淀→將顆粒型沉淀分散到細胞中,，促進DNA粘附在細胞表面→共沉淀通過內(nèi)吞作用進入胞漿→分析細胞瞬時基因表達或者選擇穩(wěn)定性傳染,。成都細胞高效轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商