細(xì)胞轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)介：轉(zhuǎn)染,，是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入,，轉(zhuǎn)染目前已成為實(shí)驗(yàn)室工作中經(jīng)常涉及的基本方法,。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑,。電穿孔法,、顯微注射和基因?qū)儆谕ㄟ^物理方法將基因?qū)爰?xì)胞的范例；化學(xué)介導(dǎo)方法很多,，如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法,、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù),；生物介導(dǎo)方法,，有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,，和現(xiàn)在比較多見的各種細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高,、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn),。細(xì)菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),，是目前轉(zhuǎn)染效率較高的方法,，同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。但是,，細(xì)菌轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,，常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性，在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及,。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,，則各有其特點(diǎn)。在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及,。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,，則各有其特點(diǎn)。天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：磷酸鈣共沉淀原理：該法可用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,。然而因其對(duì)pH,、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感，所得結(jié)果容易出現(xiàn)差異,，且對(duì)許多類型的細(xì)胞培養(yǎng)物(尤其是原代細(xì)胞)具有細(xì)胞毒性,，轉(zhuǎn)染效率較差。實(shí)驗(yàn)步驟：將核酸與氯化鈣在磷酸鹽緩沖液中混合,，同時(shí)控制好pH,、溫度等條件→室溫孵育，生成濃縮DNA的極小不溶性顆粒沉淀→將顆粒型沉淀分散到細(xì)胞中,，促進(jìn)DNA粘附在細(xì)胞表面→共沉淀通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時(shí)基因表達(dá)或者選擇穩(wěn)定性傳染成都正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價(jià)重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,，較好在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：血清A,、DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不能含血清,，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。B,、一般細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)可以耐受幾個(gè)小時(shí)沒問題,，轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率,，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化,。C、對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞,，可以使用營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基，或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清,。對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞,，建議使用**轉(zhuǎn)染試劑,。有條件的話，可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細(xì)胞兩遍,，注意洗的時(shí)候要輕,，靠邊緣緩緩加入液體，然后不要吹吸細(xì)胞而是轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板讓液體滾動(dòng)在細(xì)胞表面,。如果洗的太厲害,，細(xì)胞又損失一部分，加了脂質(zhì)體后,，細(xì)胞受影響就更大了,，死亡細(xì)胞會(huì)增多

細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用步驟：1.轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備①將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘,，溶解脂狀物,。②震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩,。2.選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞,。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,，再次震蕩。3.將混合液在室溫放置10―15分鐘,。4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。5.加入混合液,，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí),。6.到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時(shí),。轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染是將外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程，是細(xì)胞和分子生物學(xué)研究的重要工具,。

細(xì)胞電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的幾點(diǎn)建議：1.電場(chǎng)強(qiáng)度要合適合適的電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)非常重要,，電場(chǎng)強(qiáng)度不能過高，過高會(huì)增加細(xì)胞的死亡率,；也不能過低,，過低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同細(xì)胞系具有不同的較佳場(chǎng)強(qiáng)值,，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)測(cè)定所轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的較佳電場(chǎng)強(qiáng)度,。2.細(xì)胞狀態(tài)要好用于電轉(zhuǎn)的細(xì)胞一般選取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（15代以內(nèi)，傳代后2d）。因?yàn)樘幱趯?duì)數(shù)生長期的細(xì)胞分裂旺盛,，表面結(jié)構(gòu)致密比穩(wěn)定期的細(xì)胞差,，電轉(zhuǎn)后,，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng),，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA~這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少,。天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家

細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.試劑過期有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下,，還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過期的情況。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年,，百思不得其解,。較后發(fā)現(xiàn)，原來是Lipofectamine2000過期了,。換了之后,，立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn),，盡量使用開封半年內(nèi)的,，因?yàn)檫^了半年后，就算沒有過失效期,，但是細(xì)胞毒性較大增加,，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢,，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈,。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡,。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基,。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn)，其實(shí)也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清,。這個(gè)時(shí)候,，較好不要換液，不要打擾細(xì)胞,，讓它安安靜靜地休息,。但是也不能過早加入血清。過早的話,，會(huì)引起未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瘋狂生長,。天津細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑生產(chǎn)廠家