細胞轉染實驗簡介：實驗原理外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和細菌介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入;磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞;細菌法是利用包裝了外源基因的細菌傳染細胞的方法使得其進入細胞,。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴,、難度較大;細菌法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響;所以現(xiàn)在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。鄭州細胞高效轉染試劑供應商

轉染的注意事項：培養(yǎng)基中的物品物品,，比如青霉素和鏈霉素,，是影響轉染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性,，使物品可以進入細胞。這降低了細胞的活性,，導致轉染效率低,。所以，在轉染培養(yǎng)基中不能使用物品,，甚至在準備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用物品,。這樣，在轉染前也不必潤洗細胞,。對于穩(wěn)定轉染,，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因為這些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑,。另外,，為了保證無血清培養(yǎng)基中細胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量,。大多數(shù)已建立的細胞系都是非整倍體,，原代培養(yǎng)包括了表達不同基因組合的細胞的混合物。細胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變,，總染色體重組或基因調(diào)控變化等而演化,，這會導致和轉染相關的細胞行為的變化。如果隨時間發(fā)現(xiàn)這種變化,，融化一管新鮮的細胞可能會恢復原先的轉染活性,。比如，新鮮融化的NIH3T3細胞比傳代8次的細胞表現(xiàn)出更高的轉染效率,，融化細胞的進一步傳代并沒有降低轉染效率,。因此，如果觀察到轉染效率降低,，可以試著轉染新鮮培養(yǎng)的細胞以恢復較佳結果南昌細胞高效轉染試劑哪家好較適合轉染的細胞是經(jīng)過幾次傳代后達到對數(shù)生長期的細胞,。

細胞轉染效率低下的幾個大坑：1.試劑過期有時候轉染效率低下，還要考慮會不會存在試劑過期的情況,。毛博當年做轉染整整半年,，百思不得其解,。較后發(fā)現(xiàn),，原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后,，立馬成功,。根據(jù)我的經(jīng)驗,，盡量使用開封半年內(nèi)的，因為過了半年后,，就算沒有過失效期,，但是細胞毒性較大增加，而轉染效率卻較大下降,。千萬不要為了省錢,，影響實驗進度哈。2.未加血清轉染后未及時加入血清,，會導致細胞大量死亡,。一般要在轉染后的4-6小時換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗,，其實也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清,。這個時候，較好不要換液,，不要打擾細胞,，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清,。過早的話,，會引起未轉染的細胞瘋狂生長。那么,，什么是較佳時機呢,？在20%的細胞變圓的時候，就是加血清的較佳時機,。

細胞轉染的注意事項：1.細胞鋪板密度用于轉染的較佳細胞密度根據(jù)不同的細胞類型或應用而異,。因轉染試劑對細胞有毒害作用，細胞太少,，容易死,。一般轉染時，貼壁細胞密度為70%-90%,，懸浮細胞密度為2-4×106細胞/ml,，確保轉染時細胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉染效率對細胞密度很敏感,，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要,。鋪板細胞數(shù)目的增加可以增加轉染活性和細胞產(chǎn)量。細胞的融合度必須要達到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細胞系和要表達的蛋白,。CMV啟動子在大多數(shù)細胞類型中可以獲得高表達活性,。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細菌)相比,，在BHK-21中其活性較高,。這三種細菌啟動子在T細胞來源的細胞系,，如Jurkat中組成表達水平較低。轉染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細胞中CMV啟動子,，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細胞)中的CMV啟動子,。轉染試劑與細胞不匹配細胞轉染較適合的不是原代細胞。

細胞轉染實驗注意事項：1.培養(yǎng)基中的物品物品是影響轉染的培養(yǎng)基添加物,。這些物品一般對于真核細胞無毒,，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使物品可以進入細胞,。這降低了細胞的活性,，導致轉染效率降低。這時候可以選擇Entranster轉染試劑,，非脂質體試劑,，培養(yǎng)基可加物品，避免了細胞染菌,。2.設置陽性對照和陰性對照,。3.一般在轉染24-48h，靶基因即在細胞內(nèi)表達,。根據(jù)不同的實驗目的,，24-48h后即可進行靶基因表達的檢測實驗。4.如若建立穩(wěn)定的細胞系,，則可對靶細胞進行篩選,，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物，常用的真核表達基因載體的標志物有潮霉素和新霉素等,。通過緩沖液的作用以及脂質與內(nèi)體膜融合,，增大內(nèi)體的內(nèi)部滲透壓。鄭州細胞高效轉染試劑供應商

蛋白表達和培養(yǎng)基的選擇哺乳動物細胞系合成可溶的,。鄭州細胞高效轉染試劑供應商

細胞轉染的常用方法：細菌轉染：原理：對于用脂質體不能實現(xiàn)轉染的細胞,，可以采用細菌轉染?？捎糜诘鞍踪|過表達或克制,，是臨床研究中較常用的方法。它通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中,，可用于難轉染細胞,、原代細胞的穩(wěn)定性轉染。實驗步驟：通過基因克隆生成重組細菌→采用非細菌法轉染包裝細胞系,，擴增并分離得到重組細菌顆?！兓⒌味毦骸D導目的細胞（含有細菌特異性的受體）→去除培養(yǎng)物中的細菌，并加入新鮮培養(yǎng)基→分析細胞瞬時基因表達或沉默情況,。鄭州細胞高效轉染試劑供應商