系統(tǒng)示意圖如圖1所示,，紅外激光束從藍(lán)寶石激光器出射后,，由一個(gè)光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段,，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200 fs, 重復(fù)頻率80 MHz,，波長(zhǎng)在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧,。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中,，形成用于熒光激發(fā)的多焦點(diǎn)光束,。多焦點(diǎn)光束通過一個(gè)硅油浸潤(rùn)的物鏡成像到樣品上,，激發(fā)熒光信號(hào),。熒光信號(hào)由同一個(gè)物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤,，產(chǎn)生共焦效應(yīng)，隔離來自焦平面外的雜散光,。雙光子顯微鏡還可以對(duì)一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，還有一些短波長(zhǎng)可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西,，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)呢？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎,？原來,，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、觀察,！由于電磁波的波長(zhǎng)越短,，粒子性越強(qiáng)，受散射影響也就越大,。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光,，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對(duì)細(xì)胞的毒性。除此之外,，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng),，所以掃描的精確度極高，也能提高激發(fā)光效率,，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗,。進(jìn)口bruker雙光子顯微鏡光損傷雙光子顯微鏡大量運(yùn)營(yíng)在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中；

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，這一波段的光對(duì)***細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長(zhǎng)時(shí)間的研究,；☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收只局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦***）,，這樣就提高了對(duì)熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高；☆圖像對(duì)比度高：由于熒光波長(zhǎng)小于入射波長(zhǎng),，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16,，較大降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,，所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究,；

宇宙，浩瀚無(wú)垠,，在數(shù)百億光年可觀測(cè)的空間里閃爍著上萬(wàn)億個(gè)星系,。人類1400克的大腦,如同一個(gè)小小的宇宙，包含了百億級(jí)神經(jīng)元和百萬(wàn)億級(jí)的神經(jīng)突觸,，其結(jié)構(gòu)和功能上極其復(fù)雜而精密的連接,，涌現(xiàn)出意識(shí)和思想--大腦小宇宙隱藏著世界上較佳麗較深邃的奧秘。新千年伊始,，世界科技強(qiáng)國(guó)紛紛啟動(dòng)有史以來比較大規(guī)模的腦科學(xué)研究計(jì)劃,，人類探索大腦的波瀾壯闊的歷史畫卷正在展開。工欲善其事,，必先利其器,。目前，各國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃的一個(gè)重要方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究工具,。其中,，如何打破尺度壁壘，整合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的活動(dòng)和個(gè)體行為信息,，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn),。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長(zhǎng)),。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對(duì)生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊,。從雙光子到三光子科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器,。國(guó)外investigator雙光子顯微鏡光子躍遷

雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡

對(duì)生物樣品的三維觀測(cè)是了解細(xì)胞功能的重要方法之一,。目前已有的三維熒光成像技術(shù)包括光片顯微成像技術(shù),、晶格光照明技術(shù)以及激光掃描顯微成像技術(shù)（如共聚焦顯微鏡及雙光子顯微鏡）等。其中激光掃描顯微鏡利用旋轉(zhuǎn)盤可以進(jìn)行多焦點(diǎn)的激光掃描,，提高時(shí)間分辨率,，而且有利于減少活細(xì)胞成像中的光損傷。本篇文獻(xiàn)主要實(shí)現(xiàn)了可見光雙光子激發(fā)及多焦點(diǎn)激光掃描的結(jié)合,，終提高了3D延時(shí)掃描中的空間分辨率及成像對(duì)比度,，同時(shí)這也是可見光雙光子激發(fā)（v2PE）在超高分辨率顯微鏡中的應(yīng)用。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡