多光子顯微鏡成像深度深,、對比度高，在生物成像中具有重要意義,，但通常需要較高的功率,。結合時間傳播的超短脈沖可以實現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度，但近紅外波段的光本身會導致分辨率較低,?；诙喙庾由限D換材料和時間編碼結構光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)是由清華大學教授和北京大學彭研究員合作開發(fā)的?？蓪崿F(xiàn)50MHz的超高掃描速度,，突破衍射極限，實現(xiàn)超分辨率成像,。與普通熒光顯微鏡相比,，該顯微鏡經過改進，只需要較低的激發(fā)功率,。這種超快,、低功耗、多光子超分辨率技術在高分辨率生物深層組織成像中具有長遠的應用前景,。多光子顯微鏡在基礎科學和臨床診斷領域的應用范圍正在持續(xù)增長,。美國熒光多光子顯微鏡能量脈沖

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細胞分辨率下監(jiān)測體內神經元信號，這是揭示動物神經活動復雜機制的關鍵,。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經元活動,，但神經元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像,，需要明顯提高2PM的成像速率。美國離體多光子顯微鏡配置顯微鏡簡史：從光到多光子顯微鏡,。

SternandJeanMarx在評論中說：祖家能夠在更為精細的層次研究樹突的功能,，這在以前是完全不可能的。新的技術（如腦片的膜片鉗和雙光子顯微使人們對樹突的計算和神經信號處理中的作用有了更好的理解,。他們解釋了是樹突模式和形狀多樣性,，及其獨特的電、及其獨特的電化學特征使神經元完成了一系列的專門任務,。雙光子與共聚焦在發(fā)育生物學中的應用雙光子∶每2.5分鐘掃描一次,，觀察24小時，發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦∶每15分鐘掃描一次，觀察8小時后細胞分裂停止,，不能發(fā)育到桑椹胚和胚泡階段共聚焦激發(fā)時的細胞存活率為多光子系統(tǒng)的10～20%,。

多光子激光掃描顯微鏡的產業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產業(yè)主要分布在德國和日本,，德國以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為基礎,，日本以尼康和奧林巴斯為基礎。2020年以來,，這些企業(yè)占據(jù)了全球多光子激光掃描顯微鏡市場的64.44%,，它們的發(fā)展策略影響著多光子激光掃描顯微鏡市場的走向。目前,，世界市場對多光子激光掃描顯微鏡的需求正在增長,，中國市場的需求增長更快。未來五年多光子激光掃描顯微鏡市場的發(fā)展在中國將仍有巨大的發(fā)展?jié)摿?。多光子共聚焦掃描顯微鏡比雙光子共聚焦掃描顯微鏡具有更高的空間分辨率,。

使用MPM對神經元進行成像時，通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經元,，這樣不僅避免掃描到任何未標記的神經纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間,。隨機訪問掃描可以通過聲光偏轉器（AOD）來實現(xiàn),，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產生的聲波引起周期性的折射率光柵,，激光束通過光柵時發(fā)生衍射,。通過射頻電信號調控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描,，利用1對AOD,，結合其他軸向掃描技術可實現(xiàn)3D的隨機訪問掃描。但是該技術對樣本的運動很敏感,，易出現(xiàn)運動偽影,。目前，快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描,，由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被普遍的使用,。多光子顯微鏡在臨床前評價IA形態(tài)、細胞外基質,、細胞密度和血管形成等方面顯示出強大的作用,。美國離體多光子顯微鏡配置

4tune光譜檢測器，實現(xiàn)多光子顯微鏡的光譜型檢測,。美國熒光多光子顯微鏡能量脈沖

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比,，多光子顯微鏡具有光學切片和深層成像等功能，這兩個優(yōu)勢極大地促進了研究者們對于完整大腦深處神經的了解與認識。2019年,，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經元成像,、大量神經元成像、高速神經元成像這三個方面論述了相關的MPM技術,。想要將神經元活動與復雜行為聯(lián)系起來,，通常需要對大腦皮質深層的神經元進行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力,。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素,，雖然可以通過增加激光強度來解決散射問題，但這會帶來其他問題,，例如燒壞樣品,、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光,。美國熒光多光子顯微鏡能量脈沖