雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高,，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進行定點,、有生命體的觀察！美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡掃描深度

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣,，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然,，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初,，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用,。當(dāng)時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光,。美國ultimainvestigator雙光子顯微鏡的成像視野雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝,。

研究人員通過用不同激光波長并行化激光掃描（wavelengthmultiplexing），增加了相同時間內(nèi)可以成像的體積,，并同時保持較高的時間和空間分辨率,。通過引入兩種波長不同的鈣信號熒光探針，研究人員將神經(jīng)元群體的活動標(biāo)記為兩個不同顏色,，并同時用兩個不同波長的激光激發(fā)探針,，實現(xiàn)了兩個顏色的并行化數(shù)據(jù)記錄。為了實現(xiàn)三維空間成像,，研究人員還分別在兩個激光光路上配置了快速變焦系統(tǒng),，分別為電可調(diào)節(jié)透鏡（electricaltunablelens）和空間光調(diào)制器（spatiallightmodulator）。由此,，可以同時以10赫茲的速度記錄500微米500微米的10個平面,，覆蓋縱深達600微米，涵蓋了從腦皮層第2層到第5層的結(jié)構(gòu),，體積內(nèi)記錄到的神經(jīng)元可以達到2000個以上,。

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡,。熒光顯微鏡是以紫外線為光源,，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料，使其發(fā)出熒光,。相比普通光學(xué)顯微鏡,，熒光顯微鏡運用了波長更短的紫外線，再將可見光過濾掉,，提高了分辨力率,。而當(dāng)被檢物體過厚時，從不同深度發(fā)出的熒光都會打在物鏡上,，使觀察到的像模糊、發(fā)虛,，無法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu),。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，增加了激光掃描裝置,，從而解決了上述問題,。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源,，激光束經(jīng)照明孔,，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上,，對標(biāo)本焦平面上每一點進行掃描,。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測孔時先聚焦,，然后被光探頭收集,，轉(zhuǎn)化為信號輸送到計算機進行處理。這個裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時通過改變物鏡的焦距，能對不同焦平面進行掃描,，通過計算機繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。雙光子顯微鏡除了可以進行厚的組織樣品拍攝以外呢，可以在小鼠的的任何部位進行成像,。

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對***細(xì)胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小：由于激發(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象,；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦***）,，這樣就提高了對熒光的收集率,，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16,，較大降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像研究,；雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。美國雙光子顯微鏡的原理

雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動,，所以雙光子成像更清晰。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡掃描深度

王愛民副教授結(jié)合工作實例,，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用,。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，重量只為2.2克,，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像,，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部,，可實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號,，在大型動物上,，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測,。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景,，首先雙光子顯微鏡能夠進行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像，在亞微米級成像,，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似,；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r,、在體、原位,、無創(chuàng)地,，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性，區(qū)分成像,；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標(biāo)成像,，在無造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光,、二次諧波,、熒光獲得活細(xì)胞生化信息。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡掃描深度