對兩個遠距離（相距大于1-2mm）的成像部位,，通常使用兩條單獨的路徑進行成像,；對于相鄰區(qū)域,，通常使用單個物鏡的多光束進行成像。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_問題,，這個問題可以通過事后光源分離方法或時空復(fù)用方法來解決,。事后光源分離方法指的是用算法來分離光束消除串?dāng)_；時空復(fù)用方法指的是同時使用多個激發(fā)光束,，每個光束的脈沖在時間上延遲,，這樣就可以暫時分離被不同光束激發(fā)的單個熒光信號。引入越多路光束就可以對越多的神經(jīng)元進行成像,，但是多路光束會導(dǎo)致熒光衰減時間的重疊增加,，從而限制了區(qū)分信號源的能力；并且多路復(fù)用對電子設(shè)備的工作速率有很高的要求,；大量的光束也需要更高的激光功率來維持近似單光束的信噪比,，這會容易導(dǎo)致組織損傷。多光子顯微鏡在臨床前評價IA形態(tài),、細胞外基質(zhì),、細胞密度和血管形成等方面顯示出強大的作用。熒光多光子顯微鏡成像深度

因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒,，而其周期可以達到80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時,，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,，提高了熒光檢測效率。在體多光子顯微鏡作用多光子顯微鏡在基礎(chǔ)科學(xué)和臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用范圍正在持續(xù)增長,。

國內(nèi)顯微鏡制造市場目前斷層嚴重,。目前我國顯微鏡行業(yè)發(fā)展缺乏技術(shù)沉淀，20年以上經(jīng)營積累的企業(yè)十分稀缺,，深度精密制造,、光學(xué)主要部件設(shè)計及工藝嚴重制約產(chǎn)業(yè)升級。目前中國顯微鏡中如多光子顯微鏡,、共聚焦掃描和電子顯微鏡等主要集中在徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司、尼康,、奧林巴斯等國外企業(yè),。國內(nèi)具備生產(chǎn)顯微鏡能力的企業(yè)屈指可數(shù)，若國內(nèi)顯微鏡企業(yè)能打破技術(shù)壁壘,，切入顯微鏡市場,，企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營將騰躍至一個更高的格局。未來國產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡替代空間大,。目前中國使用的多光子激光掃描顯微鏡幾乎被徠卡顯微系統(tǒng),、蔡司、尼康和奧林巴斯壟斷,。國內(nèi)有能力開始生產(chǎn)多光子激光掃描顯微鏡的企業(yè)極少,，若國內(nèi)能夠制造出高性能、高可靠性的多光子激光掃描顯微鏡,，無異是會面臨極大的市場機遇,。

Ca2+是一種重要的第二信使，在調(diào)節(jié)細胞生理反應(yīng)中起著重要作用,。發(fā)展和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)觀測Ca2+熒光信號,，可以從某些方面分析生物體或細胞的變化機制，具有重要意義,。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù),，我們可以觀察到細胞內(nèi)熒光探針標記的Ca2*的時間和空間熒光圖像的變化，也可以觀察到一定水平或部分細胞內(nèi)(Ca2+)的熒光圖像和變化,。通過對單個細胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+的分布不僅在細胞的局部區(qū)域之間是不均勻的，而且在細胞內(nèi)不同深度或?qū)哟蔚木植繀^(qū)域之間也存在不同程度的Ca2+梯度,，稱為空間Ca2+梯度,。從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場,。

有許多方法可以實現(xiàn)快速光柵掃描,，例如使用振鏡進行快速2D掃描，以及將振鏡與可調(diào)電動透鏡相結(jié)合進行快速3D掃描,。而可調(diào)電動式鏡頭由于機械慣性的限制,，無法在軸向快速切換焦點，影響成像速度?，F(xiàn)在它可以被空間光調(diào)制器(SLM)取代,。遠程對焦也是實現(xiàn)3D成像的一種手段，如圖2所示,。LSU模塊中,，掃描振鏡水平掃描，ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,，通過調(diào)整M的位置實現(xiàn)軸向掃描該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,，還可以進行快速軸向掃描。為了獲得更多的神經(jīng)元成像,，可以通過調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計來放大FOV,。然而，大NA和大FOV的物鏡通常很重,，不能快速移動以進行快速軸向掃描,，因此大FOV系統(tǒng)依賴于遠程聚焦、SLM和可調(diào)電動透鏡,。多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學(xué)家普遍的運用于實驗中,。美國模塊化多光子顯微鏡長時間觀察

使用雙光子顯微鏡觀察標本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性,。熒光多光子顯微鏡成像深度

2020年,，TonmoyChakraborty等人提出了一種加快2PM軸向掃描速度的方法[2]。在光學(xué)顯微鏡中,，物鏡或樣品的緩慢軸向掃描速度限制了體積成像的速度,。近年來，通過使用遠程聚焦技術(shù)或電可調(diào)諧透鏡（ETL）已經(jīng)實現(xiàn)了快速軸向掃描,；但是,，遠程聚焦中反射鏡的機械驅(qū)動會限制軸向掃描速度，ETL會引入球面像差和更高階像差,，從而無法進行高分辨率成像,。為了克服這些局限性，該組引入了一種新穎的光學(xué)設(shè)計,，能將橫向掃描轉(zhuǎn)換為可用于高分辨率成像的無球差的軸向掃描,。該設(shè)計有兩種實現(xiàn)方式,，第一種能夠執(zhí)行離散的軸向掃描，另一種能夠進行連續(xù)的軸向掃描,。具體裝置如圖3a所示,，由兩個垂直臂組成，每個臂中都有一個4F望遠鏡和一個物鏡,。遠程聚焦臂包含一個檢流掃描鏡（GSM）和一個空氣物鏡（OBJ1）,，另一個臂（稱為照明臂）由一個水浸物鏡（OBJ2）構(gòu)成。將這兩個臂對齊,，以使GSM與兩個物鏡的后焦平面共軛,。準直的激光束被偏振分束器反射到遠程聚焦臂中，GSM對其進行掃描,，進而使得OBJ1產(chǎn)生的激光焦點進行橫向掃描,。熒光多光子顯微鏡成像深度