雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高,。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,。基于以上分析,，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰,。雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,。國(guó)外雙光子顯微鏡熒光探測(cè)

雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子,；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于,，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域,；因信號(hào)背景比高,，而具有更高的對(duì)比度；因激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。國(guó)外雙光子顯微鏡熒光探測(cè)雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖光,，是通過物鏡匯聚的。

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像,，而1997年在Svoboda測(cè)量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動(dòng)態(tài)后,，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是,，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實(shí)驗(yàn)室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強(qiáng)大的多光子介觀顯微鏡,，其成像視場(chǎng)達(dá)到5毫米，能夠跨多個(gè)腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像,。根據(jù)清華大學(xué)單一采購(gòu)來源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場(chǎng)是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚***生物組織三維成像中不可或缺的工具,。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計(jì)了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,，發(fā)展速度可見一斑,。

1.生物組織對(duì)紅外光的吸收弱，對(duì)可見光吸收強(qiáng)。類似的,，平時(shí)用手電筒照射手指,，會(huì)看到手通透紅亮，也是由于生物組織對(duì)長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光吸收少,。2.生物組織對(duì)紅外光的散射弱,。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長(zhǎng)λ的四次方。類似的,，早晨的太陽(yáng)非常紅,，也就是因?yàn)殚L(zhǎng)波長(zhǎng)的紅光穿透力更強(qiáng)。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長(zhǎng)波長(zhǎng)的紅外光比可見光對(duì)生物組織的穿透能力強(qiáng),。與單光子顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）相比,，雙光子顯微鏡可以使用約二倍波長(zhǎng)的激光去激發(fā)熒光團(tuán)。長(zhǎng)波長(zhǎng)光束散射程度低(RayleighScattering),，所以穿透能力強(qiáng),。雙光子顯微鏡有哪些分類呢？

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子,；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率,。雙光子顯微鏡廠家有哪些,？ultimainvestigator雙光子顯微鏡商家電話

雙光子顯微鏡不需要共聚焦，提高了熒光檢測(cè)效率,。國(guó)外雙光子顯微鏡熒光探測(cè)

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn),，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個(gè)問題,，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高,。國(guó)外雙光子顯微鏡熒光探測(cè)