雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加地安全,。成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備,。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細,，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標本的“透明度”提高。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細胞進行實驗,，還有一些短波長可以利用雙光子特性進行特定實驗,。

雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進行亞細胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動,。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動,，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快了。目前,，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實現(xiàn),，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像,。因此,，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM,。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時間延遲的聚焦陣列。然后,，該模塊被集成到一個帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標準雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示。光源是重復頻率為1MHz的920nm激光器,。FACED模塊可以產(chǎn)生80個脈沖焦點,，脈沖時間間隔為2ns。這些焦點是虛擬源的圖像,。虛光源越遠,，物鏡處的光束尺寸越大，焦點越小,。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡,，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率。

通過并行化不同激光波長的激光掃描,，研究人員增加了在相同時間內(nèi)可以成像的體積,，同時保持了高的時間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號熒光探針,，將神經(jīng)元群體的活動標記為兩種不同的顏色,，同時激發(fā)兩種不同波長的探針，從而實現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄,。為了實現(xiàn)三維空間成像,，研究人員還在兩個激光束上配置了快速變焦系統(tǒng)，即一個電透鏡和一個空間光調(diào)制器,。因此,，可以以10Hz的速度同時記錄10個500微米和500微米的平面,，覆蓋600微米的深度，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu),，體積內(nèi)可以記錄2000多個神經(jīng)元,。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的,。

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應用,。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡作用

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在國家自然科學基金委國家重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，北京大學分子醫(yī)學研究所,、信息科學技術(shù)學院,、動態(tài)成像中心、生命科學學院,、工學院聯(lián)合中國人民醫(yī)學科學院組成跨學科團隊,，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰,、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3),，并已申請多項,。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡磷光壽命計數(shù)