和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣,，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然,，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡,。1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。美國雙光子顯微鏡成像視野

王愛民副教授結(jié)合工作實例,，展示了雙光子顯微鏡的研發(fā)與應(yīng)用。歷經(jīng)3年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，重量只為2.2克,，這一微型顯微鏡獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰、穩(wěn)定的圖像,，該顯微鏡適于佩戴在小動物頭部,，可實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號,，在大型動物上,，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測,。雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像,，在亞微米級成像,，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r,、在體,、原位、無創(chuàng)地,，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性,，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標(biāo)成像,，在無造影劑的前提下,，利用自發(fā)熒光、二次諧波,、熒光獲得活細(xì)胞生化信息,。ultima2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?/p>

目前，世界各國的腦科學(xué)研究如火如荼,，中國的腦計劃也即將啟動,。其中，關(guān)于全景式解析腦連接圖譜和功能動態(tài)圖譜的研究成為重點研究方向,，而如何打破尺度壁壘,，融合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動與大腦整體的信息處理和個體行為信息，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個關(guān)鍵挑戰(zhàn),。2021年1月6日,，由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所牽頭，聯(lián)合北大信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院電子學(xué)系,、工學(xué)院以及中國人民******醫(yī)學(xué)科學(xué)院等組成的跨學(xué)科團隊,，在NatureMethods在線發(fā)表題為“Miniaturetwo-photonmicroscopyforenlargedfield-of-view,multi-plane,andlong-termbrainimaging”的文章。文中報道了第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0,，其成像視野是該團隊于2017年發(fā)布的低1代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時具備三維成像能力,，獲取了小鼠在自由運動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個月的追蹤記錄,。

要想讓激發(fā)激光進入更深的層面,，大致可從兩個方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高,。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞,，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細(xì)胞,，使掃描能更好地進行。微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是,。

Winfried Denk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100 fs脈寬,、630 nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年,，Chris Xu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔,，提高了熒光檢測效率。國外ultima2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)商

雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像,。美國雙光子顯微鏡成像視野

從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。美國雙光子顯微鏡成像視野

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