雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用。幾年前雙光子**過(guò)期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠(chǎng)家估計(jì)不少于10家以上,。即便如此，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多,，首先是便宜,，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器，那就更很省錢(qián)了,。其次是靈活,，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配，改動(dòng)也靈活,。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊(duì)伍,，一趟走下來(lái)可以把新手帶出來(lái)，后期維護(hù)也更加自由,。當(dāng)然壞處也不少,，首先是操心，特別是第1次搭的時(shí)候,，開(kāi)始要想方案,，后來(lái)要解決各種實(shí)際問(wèn)題。其次是花時(shí)間,，加上買(mǎi)配件的時(shí)間,，比買(mǎi)一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長(zhǎng)。現(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol,，大多是老外寫(xiě)的，中文的較少,。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候，容易走彎路,，多花錢(qián),，也多花時(shí)間，再加上雙光子的重要器件都需要從國(guó)外購(gòu)買(mǎi),，在國(guó)內(nèi)買(mǎi)這些東西耗時(shí)較長(zhǎng),。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn),，貼出來(lái)分享,，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線(xiàn)性過(guò)程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線(xiàn)性過(guò)程，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度,，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見(jiàn)光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小,。雙光子顯微鏡investigator微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)是,。

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像，而1997年在Svoboda測(cè)量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹(shù)突鈣離子動(dòng)態(tài)后,，雙光子顯微鏡的潛能開(kāi)始完全凸顯,。值得一提的是，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實(shí)驗(yàn)室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強(qiáng)大的多光子介觀(guān)顯微鏡,，其成像視場(chǎng)達(dá)到5毫米,，能夠跨多個(gè)腦區(qū)進(jìn)行高速功能成像。根據(jù)清華大學(xué)單一采購(gòu)來(lái)源的**指導(dǎo)意見(jiàn)：這種顯微鏡的視場(chǎng)是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來(lái),，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具,。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線(xiàn)性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱(chēng)為多光子顯微鏡。自1990年以來(lái)每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,，發(fā)展速度可見(jiàn)一斑,。

臨研所、病理科和科研處邀請(qǐng)北京大學(xué)王愛(ài)民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告,。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)潘琳老師主持,。王愛(ài)民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位，后于英國(guó)巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國(guó)際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號(hào)，該成果獲得了2017年度“中國(guó)光學(xué)進(jìn)展”和“中國(guó)科學(xué)進(jìn)展”,，并被Nature Methods評(píng)為2018年度“年度方法--無(wú)限制行為動(dòng)物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來(lái)即時(shí)病理,、離體組織檢測(cè)、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法,。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,。

雙光子顯微鏡的應(yīng)用由于適合動(dòng)態(tài)成像，雙光子顯微鏡一經(jīng)問(wèn)世便很快應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué),、遺傳發(fā)育,、藥物代謝等領(lǐng)域。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對(duì)***神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),、離子濃度,、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分子相互作用等進(jìn)行直接成像監(jiān)測(cè),，而且能夠進(jìn)行光裂解,、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱。同時(shí),，雙光子顯微鏡能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)**在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,，并可對(duì)**治療過(guò)程中*細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)和評(píng)估。隨著光學(xué)技術(shù),、熒光探針技術(shù),、計(jì)算機(jī)成像技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微技術(shù)會(huì)得到更大提升和更廣的應(yīng)用,，未來(lái)不僅用于基礎(chǔ)研究,，也將擴(kuò)展到臨床應(yīng)用。雙光子顯微鏡大量運(yùn)營(yíng)在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中,；國(guó)外ultimainvestigator雙光子顯微鏡授權(quán)公司

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡

使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測(cè)體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào),，這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡（2PM）可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng),；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng),，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來(lái)說(shuō)太快。目前電壓成像主要通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像，需要較提高2PM的成像速率,。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),，其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn),，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿(mǎn)物鏡,，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm。國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡

因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司發(fā)展規(guī)模團(tuán)隊(duì)不斷壯大,，現(xiàn)有一支專(zhuān)業(yè)技術(shù)團(tuán)隊(duì),，各種專(zhuān)業(yè)設(shè)備齊全。在滔博生物近多年發(fā)展歷史,，公司旗下現(xiàn)有品牌Inscopix,envisionTEC,rokit,piezosleep,stoeltingco,unipick,neuronexus,scientifica,alphaomega,divescope,invivo等,。公司以用心服務(wù)為重點(diǎn)價(jià)值，希望通過(guò)我們的專(zhuān)業(yè)水平和不懈努力,，將生物科技,，醫(yī)藥科技領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)開(kāi)發(fā)、技術(shù)咨詢(xún),、技術(shù)服務(wù),、技術(shù)轉(zhuǎn)讓?zhuān)瑢?shí)驗(yàn)室設(shè)備、儀器儀表,、醫(yī)療器械,、計(jì)算機(jī)、軟件及輔助設(shè)備銷(xiāo)售,，計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理,，貨物及技術(shù)進(jìn)出口業(yè)務(wù),。 成像平臺(tái)： 1. Inscopix自由活動(dòng)超微顯微成像系統(tǒng) 2. DiveScope多通道內(nèi)窺鏡系統(tǒng) 3. 雙光子顯微鏡 動(dòng)物行為學(xué)平臺(tái)： 1. PiezoSleep無(wú)創(chuàng)睡眠檢測(cè)系統(tǒng) 2. 自身給藥,、條件恐懼,、斯金納、睡眠剝奪,、跑步機(jī),、各類(lèi)經(jīng)典迷宮等 神經(jīng)電生理： 1.NeuroNexus神經(jīng)電極 2.多通道電生理信號(hào)采集系統(tǒng) 3.膜片鉗系統(tǒng) 4.AO功能神經(jīng)外科臨床電生理平臺(tái) 顯微細(xì)胞： 1. UnipicK單細(xì)胞挑選及顯微切割系統(tǒng) 科研/臨床級(jí)3D打印 1. 德國(guó)envisionTEC 3D Bioplotter生物打印機(jī) 2. 韓國(guó)Invivo醫(yī)療級(jí)生物打印機(jī)等。等業(yè)務(wù)進(jìn)行到底,。誠(chéng)實(shí),、守信是對(duì)企業(yè)的經(jīng)營(yíng)要求，也是我們做人的基本準(zhǔn)則,。公司致力于打造***的nVista,，nVoke，3D bioplotte,，invivo,。