細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性,。當(dāng)個細(xì)胞興奮時，產(chǎn)生了一個電沖動,，此時,，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi)，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合,，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推,，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去,，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí),、記憶等大腦的高級功能,。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM,，而細(xì)胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少,。眾所周知,，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響,。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體,、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性,。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞。雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。進口bruker雙光子顯微鏡掃描深度

2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP,，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用,，獲得了諾貝爾化學(xué)獎，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動,。光學(xué)成像本身具有高分辨率,、高通量、非侵入和非毒性等特點,，再與熒光蛋白以及熒光染料等標(biāo)記物在細(xì)胞中的定位與表達技術(shù)相結(jié)合,，使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細(xì)胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進行動態(tài)觀察,。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的,，生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前,，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細(xì)胞體系中研究,。然而與細(xì)胞生物學(xué)研究有所不同的是，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律,。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收,，根本無法穿透如此深的組織進行成像。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy,，簡稱TPM）的發(fā)明,，則為此類研究帶來了希望。雙光子顯微鏡特有的非線性光學(xué)特性,，再加上其工作波長處在紅外區(qū)域等特點,，令其在生物體組織內(nèi)的穿透深度較大提高，使得雙光子顯微鏡成為神經(jīng)科學(xué)家進行神經(jīng)成像較理想的工具,。進口熒光激光雙光子顯微鏡商家電話優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。

要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理。一種方法是運用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本“透明度”提高,。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞,，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細(xì)胞,，使掃描能更好地進行。

Denk很快就將雙光子顯微鏡用于神經(jīng)元成像,，而1997年在Svoboda測量完整老鼠大腦的錐體神經(jīng)元的感官刺激誘導(dǎo)樹突鈣離子動態(tài)后,，雙光子顯微鏡的潛能開始完全凸顯。值得一提的是,，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院Svoboda實驗室和Thorlabs在2016年合作推出了一種強大的多光子介觀顯微鏡,，其成像視場達到5毫米，能夠跨多個腦區(qū)進行高速功能成像,。根據(jù)清華大學(xué)單一采購來源的**指導(dǎo)意見：這種顯微鏡的視場是普通雙光子顯微鏡的10倍,。30年來，雙光子顯微鏡已成為較厚生物組織三維成像中不可或缺的工具,。從雙光子到三光子甚至四光子,，這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡。下圖統(tǒng)計了自1990年以來每年發(fā)表的多光子顯微鏡文章數(shù)量,，發(fā)展速度可見一斑,。雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進行定點、有生命體的觀察,！

高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞,，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,，而其頻率可以達到80至100兆赫，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細(xì)胞,，使掃描能更好地進行。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動力學(xué)情形,。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢,。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間,。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點，避免了層與層之間的互相干擾,，極大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度,。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例,；國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡商家

雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點,，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢？進口bruker雙光子顯微鏡掃描深度

微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式,，可用于在動物覓食,、哺乳、跳臺,、打斗,、嬉戲、睡眠等自然行為條件下,，或者在學(xué)習(xí)前,、學(xué)習(xí)中和學(xué)習(xí)后，長時程觀察神經(jīng)突觸,、神經(jīng)元,、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、遠(yuǎn)程連接的腦區(qū)等多尺度,、多層次動態(tài)變化,。該成果在2016年底美國神經(jīng)科學(xué)年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議上報告后,，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內(nèi)的國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)家的高度贊譽,。冷泉港亞洲腦科學(xué)專題會議、美國明顯神經(jīng)科學(xué)家加州大學(xué)洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評述中寫道,，“從任何一個標(biāo)準(zhǔn)來看,，這款顯微鏡都了一項重大技術(shù)發(fā)明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的方式,。它所開啟的大門,，甚至超越了神經(jīng)元和樹突成像。系統(tǒng)神經(jīng)生物學(xué)正在進入一個新的時代,，即通過對細(xì)胞群體中可辨識的細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的復(fù)雜生物學(xué)事件進行成像觀測,，從而更加深刻地理解進化所造就的大腦環(huán)路實現(xiàn)復(fù)雜行為的重要工程學(xué)原理。毫無疑問,，這項非凡的發(fā)明讓我們向著這一目標(biāo)邁進了一步,。”進口bruker雙光子顯微鏡掃描深度

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