相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀察尺度更小的東西，冷凍電鏡更是可以觀察有活性的生物大分子,，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢呢,？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎,？原來，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn),、***觀察,！由于電磁波的波長越短，粒子性越強(qiáng),，受散射影響也就越大,。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對細(xì)胞的毒性,。除此之外,，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng),，所以掃描的精確度極高,，也能提高激發(fā)光效率,，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗,。雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢,？2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強(qiáng)度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小,。美國布魯克雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,；

首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù)。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種,，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像,。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射,，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射,，但通過探測器前的（pinhole），有焦平面上的熒光信號能被探測器接收,。也就是說,，每個(gè)時(shí)刻，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號被探測,。通過點(diǎn)掃描的方式,，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號就可以組合出終的圖像。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像,。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信號,。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn)，出才會(huì)激發(fā)出熒光,。也就是說,，雙光子顯微鏡中，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號被探測,，并且連焦平面外的熒光信號也不會(huì)有,。

2020年，臨研所,、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告,。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺潘琳老師主持。王愛民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動(dòng)物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時(shí)病理,、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像,，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢？答案是否定的,，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn),，何況一臺儀器呢，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝,；2. 共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對樣品進(jìn)行淬滅,；3. 由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個(gè)Z軸的層面，所以對于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā),，對于一些特殊激發(fā)波長的實(shí)驗(yàn)，效率非常低,。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個(gè)長波長的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子,；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有 100 飛秒,，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?國內(nèi)investigator雙光子顯微鏡商家電話

雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點(diǎn),，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話

其實(shí)電子顯微鏡相比于光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢或者存在的比較大意義,，準(zhǔn)確的來說,，不在于放大倍數(shù)，而在于超高的分辨率,。這兩者是不同的,。通俗的來說，就是進(jìn)行觀察的時(shí)候,，除了要將物體放大,，還需要能將它與相鄰的其他物體分辨開來,。如果兩個(gè)相鄰微粒的圖像在光學(xué)顯微鏡下，即使放大到很大,，看到的可能卻是兩個(gè)相交的亮斑（艾里斑）,，而沒有明顯的界限（更不用說細(xì)節(jié)了），這表示是分辨率不夠,。拋開分辨率談放大倍數(shù)是沒有意義的,。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，約等于光波波長的一半,，通常被說成是光學(xué)顯微鏡放大極限,，其實(shí)準(zhǔn)確地來說，應(yīng)該叫做分辨率的極限,。而其產(chǎn)生的原因是光的衍射,，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性,，于是用電子代替光的電子顯微鏡成為可能,。電子顯微鏡也有多種，題主說的是像REM的,。電鏡也存在用衍射規(guī)則觀察的，比如低能電子衍射（LEED）和透射電鏡（TEM）,。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)其周期性的特點(diǎn)而生成倒易空間里的衍射圖像，借助elward球或者傅里葉變換就可以轉(zhuǎn)換到實(shí)空間,，得到真正的晶體表面圖像了,。2PPLUS雙光子顯微鏡廠家電話

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