雙光子顯微鏡是一種先進的成像技術,，能夠實現細胞或組織的深層觀察,。它的主要特點是使用雙光子激發(fā)來產生熒光，從而實現對生物樣品的高分辨率成像,。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性,，將高能激光束聚焦到生物樣品中,，激發(fā)出熒光。這個過程需要使用一個特殊的雙光子激發(fā)源,，它能夠將一個光子轉換為兩個光子,，其中一個光子用于激發(fā)熒光，另一個光子則用于成像,。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性,，可以實現對生物樣品的高分辨率成像，特別是對于深層組織的觀察,。穿透深度大：雙光子激光的波長較長,，能夠更好地穿透生物組織，從而實現對深層細胞的觀察,。熒光壽命長：雙光子激發(fā)產生的熒光壽命比單光子激發(fā)產生的熒光壽命長,，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標記物。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低,，因此對生物樣品的損傷較小,，可以減少光毒性,。總之,，雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術,，可以用于生物學、醫(yī)學,、材料科學等領域的研究,。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動,，所以雙光子成像更清晰,。進口investigator雙光子顯微鏡成像視野

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出，30年后因為有了激光才得到實驗驗證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當于和頻產生非線性過程,，這要求極高的電場強度，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關，所以關鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠未實現商用。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。激光熒光雙光子顯微鏡作用雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應用,；

1990年初，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用。當時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗,。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數據則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。

雙光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了,，目前已經在生命科學和材料科學中廣泛應用,。幾年前雙光子**過期后，已經推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上,。即便如此,，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多,，首先是便宜,，尤其是實驗室已經有飛秒激光器，那就更很省錢了,。其次是靈活,，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活,。結束后的好處就是可以鍛煉隊伍,，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由,。當然壞處也不少,，首先是操心，特別是第1次搭的時候,，開始要想方案,，后來要解決各種實際問題。其次是花時間,，加上買配件的時間,，比買一臺現成的商業(yè)化雙光子耗時長?，F在已經有不少關于如何搭雙光子顯微鏡的文章，各種protocol,，大多是老外寫的,，中文的較少。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒有經驗的時候,，容易走彎路，多花錢,，也多花時間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買，在國內買這些東西耗時較長,。因此,，我想總結一下我們的經驗，貼出來分享,，希望能幫到想自己動手的實驗室雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。

隨著技術的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化,。結合其特點,，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進。為了使激發(fā)激光進入更深的層次,，可以從器件優(yōu)化和標本改造兩個方面入手,。關于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細,，集中能量,，讓激光穿透得更深。對于樣品,，物質的吸收和散射是影響光傳播的主要因素,。為了解決這個問題，我們需要將樣本透明化,。一種方法是用某種物質浸泡標本,，使其中的物質(主要是脂質)被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類,，從而提高標本的“透明度”,。雙光子顯微鏡結合了雙光子激發(fā)技術和激光掃描共聚顯微鏡。ultimainvestigator雙光子顯微鏡掃描深度

雙光子顯微鏡成像技術及不同轉基因小鼠開展對多種臟器的成像研究,。進口investigator雙光子顯微鏡成像視野

隨著技術的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標本改造,。關于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細,，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關于標本,，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射,，解決這個問題，我們需要對樣本進行透明化處理,。一種方法是運用某種物質將標本浸泡,，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質電解,，讓標本“透明度”提高,。進口investigator雙光子顯微鏡成像視野