多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展,,世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本,,德國(guó)是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為,,而日本以尼康和奧林巴斯公司為,,2020年,上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng) 64.44%的市場(chǎng)份額,,其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向,。目前世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長(zhǎng),,中國(guó)市場(chǎng)這方面的需求增長(zhǎng)更快,,未來(lái)五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國(guó)將具有很大的發(fā)展?jié)摿?。多光子顯微鏡已經(jīng)被生物學(xué)家普遍的運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)中。美國(guó)多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作
比較兩表格中的相關(guān)參數(shù)可以看出,,基于分子光學(xué)標(biāo)記的成像技術(shù)已經(jīng)在生物活檢和基因表達(dá)規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢(shì),。例如,正電子發(fā)射斷層成像(PET)可實(shí)現(xiàn)對(duì)分子代謝的成像,,空間分辨率∶1-2mm,,時(shí)間分辨率;分鐘量級(jí)。與PET比較,,光學(xué)成像的應(yīng)用場(chǎng)合更廣(可測(cè)量更多的參數(shù),,請(qǐng)參見表1-1),且具有更高的時(shí)間分辨率(秒級(jí)),,空間分辨率可達(dá)到微米,。因此,二者相比,,雖然光學(xué)成像在測(cè)量深度方面不及PET,,但在測(cè)量參數(shù)種類與時(shí)空分辨率方面有一定優(yōu)勢(shì)。對(duì)于小動(dòng)物(如小白鼠)研究來(lái)說(shuō),,光學(xué)成像技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)小動(dòng)物整體成像和在體基因表達(dá)成像,。例如,初步研究表明,,熒光介導(dǎo)層析成像可達(dá)到近10cm的測(cè)量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)在體成像,。美國(guó)嚙齒類多光子顯微鏡作用多光子顯微鏡中,極短的激光脈沖聚焦在樣品上的緊密點(diǎn)上,,激發(fā)熒光團(tuán)產(chǎn)生圖像,。
雙光子顯微鏡工作原理是將超快的紅外激光脈沖傳輸?shù)綐悠分校跇悠分信c組織或熒光標(biāo)記相互作用,,這些組織或熒光標(biāo)記發(fā)出用于創(chuàng)建圖像的信號(hào),。雙光子顯微鏡被多用于生物學(xué)研究,因?yàn)樗軌虍a(chǎn)生高分辨率的3-D圖像,,深度達(dá)1毫米,。然而,這些優(yōu)點(diǎn)帶來(lái)了有限的成像速度,,因?yàn)槲⒐鈼l件需要逐點(diǎn)圖像采集和重建的點(diǎn)檢測(cè)器,。為了加快成像速度,科學(xué)家之前開發(fā)了一種多焦點(diǎn)激光照明方法,,該方法使用數(shù)字微鏡設(shè)備(DMD),,這是一種通常用于投影儀的低成本光掃描儀。此前人們認(rèn)為這些DMD不能與超快激光一起工作,。然而現(xiàn)在解決了這個(gè)問(wèn)題,,這使得DMD在超快激光應(yīng)用中得以應(yīng)用,,這些應(yīng)用包括光束整形、脈沖整形,、快速掃描和雙光子成像,。DMD在樣品內(nèi)隨機(jī)選擇的位置上產(chǎn)生5到30點(diǎn)聚焦激光。
多光子激發(fā)掃描顯微成像系統(tǒng)的不足,。只能對(duì)熒光成像,。如果樣品包括能夠吸收激發(fā)光的色團(tuán),如色素,,樣品可能受到熱損傷,。分辨率略有降低,雖然可以通過(guò)同時(shí)利用共焦的小孔得到改善,,但是信號(hào)會(huì)有損耗,。受昂貴的超快激光器限制,多光子掃描顯微鏡的成本較高,。多光子激發(fā)顯微鏡應(yīng)用舉例,。動(dòng)物和腦片神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能、動(dòng)物腦皮層的成像,、胚胎發(fā)育過(guò)程的長(zhǎng)時(shí)間動(dòng)態(tài)觀測(cè),、多光子激發(fā)光解籠、細(xì)胞內(nèi)微區(qū)鈣動(dòng)力學(xué),、多光子激發(fā)自發(fā)熒光,、其它應(yīng)用。從雙光子到三光子甚至四光子,,這種非線性成像技術(shù)通常也被統(tǒng)稱為多光子顯微鏡,。
使用MPM對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行成像時(shí),通過(guò)隨機(jī)訪問(wèn)掃描—即激光束在整個(gè)視場(chǎng)上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元,,這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維,,還可以優(yōu)化激光束的掃描時(shí)間。隨機(jī)訪問(wèn)掃描可以通過(guò)聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)來(lái)實(shí)現(xiàn),,其原理是將具有一個(gè)射頻信號(hào)的壓電傳感器粘在合適的晶體上,,所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵,激光束通過(guò)光柵時(shí)發(fā)生衍射,。通過(guò)射頻電信號(hào)調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向,,這樣使用1個(gè)AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描,利用1對(duì)AOD,,結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問(wèn)掃描,。但是該技術(shù)對(duì)樣本的運(yùn)動(dòng)很敏感,易出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)偽影,。目前,,快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描,,由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動(dòng)偽影而被普遍的使用。OCT可以用于損傷修復(fù)監(jiān)測(cè),。Yeh等用OCT,、多光子顯微鏡。美國(guó)全自動(dòng)多光子顯微鏡成像區(qū)域
光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),,早在20多年前就有了,目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。美國(guó)多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作
快速光柵掃描有多種實(shí)現(xiàn)方式,,使用振鏡進(jìn)行快速2D掃描,將振鏡和可調(diào)電動(dòng)透鏡結(jié)合在一起進(jìn)行快速3D掃描,,但可調(diào)電動(dòng)透鏡由于機(jī)械慣性的限制在軸向無(wú)法快速進(jìn)行焦點(diǎn)切換,,影響成像速度,現(xiàn)可使用空間光調(diào)制器(SLM)代替,。遠(yuǎn)程聚焦也是一種實(shí)現(xiàn)3D成像的手段,,如圖2所示。在LSU模塊中,,掃描振鏡進(jìn)行橫向掃描,,ASU模塊包括物鏡L1和反射鏡M,通過(guò)調(diào)控M的位置實(shí)現(xiàn)軸向掃描,。該技術(shù)不僅可以校正主物鏡L2引入的光學(xué)像差,,還可以進(jìn)行快速的軸向掃描。想要獲得更多神經(jīng)元成像,,可以通過(guò)調(diào)整顯微鏡的物鏡設(shè)計(jì)來(lái)擴(kuò)大FOV,,但是具有大NA和大FOV的物鏡通常重量較大,無(wú)法快速移動(dòng)以進(jìn)行快速軸向掃描,,因此大型FOV系統(tǒng)需要依賴于遠(yuǎn)程聚焦,、SLM和可調(diào)電動(dòng)透鏡。美國(guó)多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作
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