現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和科技的進步,，特別是隨著后基因組時代的到來,，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞模型,，為在體研究基因表達規(guī)律,、分子間的相互作用、細胞的增殖,、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo),、誘導(dǎo)分化、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學(xué)條件,。然而,，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學(xué)方法，已經(jīng)對基因表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用進行了深入,、細致的研究,，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時、動態(tài)監(jiān)測,。在細胞的生理過程中,，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達,、修飾和相萬作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化,。目前的分子生物學(xué)方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些變化,，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質(zhì)之間的相互作用又至關(guān)重要。因此,，發(fā)展能用于,、動態(tài)、實時,、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法是非常有必要的,。實現(xiàn)細胞層面觀察，多光子顯微鏡技術(shù)助力醫(yī)學(xué)突破,。Ultima Investigator多光子顯微鏡長時間觀察

對于雙光子(2P)成像,，散焦和近表面熒光激發(fā)是兩個相對較大的深度限制因素,，而對于三光子(3P)成像，這兩個問題**減少,。  然而,，由于熒光團的吸收截面遠小于2P，三光子成像需要更高的脈沖能量才能獲得與2P相同激發(fā)強度的熒光信號,。  功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡要求更高,，后者需要更快的掃描速度以便及時采樣神經(jīng)元活動。  為了在每個像素的停留時間內(nèi)收集足夠的信號,，需要更高的脈沖能量,。  復(fù)雜的行為通常涉及大規(guī)模的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)既有本地連接,，也有遠程連接,。  為了將神經(jīng)元的活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)測* * *分布的超大型神經(jīng)元的活動,。  大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)將在幾十毫秒內(nèi)處理輸入的刺激,。  為了理解這種快速神經(jīng)元動力學(xué)，MPM需要快速成像神經(jīng)元的能力,。  快速MPM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。  清醒動物多光子顯微鏡研究高能短脈沖激光，多光子顯微鏡實現(xiàn)超快,、超高清成像速度,。

多束掃描技術(shù)可以同時對神經(jīng)元組織的不同位置進行成像。該技術(shù):對于兩個遠程成像位置(相距1-2mm以上),，通常采用兩個**的路徑進行成像,；對于相鄰區(qū)域，通常使用單個物鏡的多個光束進行成像,。多光束掃描技術(shù)必須特別注意激發(fā)光束之間的串?dāng)_,，這可以通過事后光源分離或時空復(fù)用來解決。事后光源分離法是指分離光束以消除串?dāng)_的算法,；時空復(fù)用法是指同時使用多個激發(fā)光束,，每個光束的脈沖在時間上被延遲，使不同光束激發(fā)的單個熒光信號可以暫時分離,。引入的光束越多,，可以成像的神經(jīng)元越多，但多束會導(dǎo)致熒光衰減時間重疊增加,，從而限制了分辨信號源的能力,；并且復(fù)用對電子設(shè)備的工作速度要求很高；大量的光束也需要較高的激光功率來維持單束的信噪比,，這樣容易導(dǎo)致組織損傷,。

Ca2+是一種重要的第二信使,，在調(diào)節(jié)細胞生理反應(yīng)中起著重要作用。發(fā)展和利用雙光子熒光顯微成像技術(shù)觀測Ca2+熒光信號,，可以從某些方面分析生物體或細胞的變化機制,，具有重要意義。利用雙光子熒光顯微成像技術(shù),，我們可以觀察到細胞內(nèi)熒光探針標(biāo)記的Ca2*的時間和空間熒光圖像的變化,，也可以觀察到一定水平或部分細胞內(nèi)(Ca2+)的熒光圖像和變化。通過對單個細胞的研究發(fā)現(xiàn),，Ca2+的分布不僅在細胞的局部區(qū)域之間是不均勻的,，而且在細胞內(nèi)不同深度或?qū)哟蔚木植繀^(qū)域之間也存在不同程度的Ca2+梯度，稱為空間Ca2+梯度,。中國市場多光子顯微鏡進出口貿(mào)易趨勢,。

多光子顯微鏡對成像深度的改善利用紅光或紅外光激發(fā)，光散射?。ㄐ×Ｗ拥纳⑸渑c波長的四次方的成反比）,。不需要***，能更多收集來自成像截面的散射光子,。***不能區(qū)分由離焦區(qū)域或焦點區(qū)發(fā)射出的散射光子,，多光子在深層成像信噪比好。單光子激發(fā)所用的紫外或可見光在光束到達焦平面之前易被樣品吸收而衰減,，不易對深層激發(fā),。多光子熒光成像的特點。深度成像∶與共聚焦相比能更好地對厚散射物質(zhì)成像,。信噪比∶多光子吸收采用的波長是單光子吸收的2倍以上,，所以顯微試樣中的瑞利散射更小，熒光測定的信噪比更高,。觀察活細胞∶離子測量（i.e.Ca2+）,，GFP，發(fā)育生物學(xué)等—減少了光毒性和光漂白,，能對細胞長時間觀察,。4tune光譜檢測器，實現(xiàn)多光子顯微鏡的光譜型檢測,。進口多光子顯微鏡單分子成像定位

點掃描多光子顯微鏡可以深入樣本并捕捉高質(zhì)量的圖像，但這個過程極其緩慢,，因為圖像是一次形成一個點,。Ultima Investigator多光子顯微鏡長時間觀察

對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素,，而對于三光子（3P）成像這兩個問題大大減小,，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多,，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高,，它需要更快速的掃描,，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量,，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號,。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠程的連接,。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來,，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激,，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué),，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力?？焖費PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù),。Ultima Investigator多光子顯微鏡長時間觀察