像差問題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者,。像差會(huì)使光波前發(fā)生形變,，不僅降低成像的信噪比和分辨率,，使得很多時(shí)候我們只能“霧里看花”，更甚者,，產(chǎn)生贗像,，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對(duì)雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重,，因?yàn)樵谀抢?，熒光信?hào)對(duì)入射光強(qiáng)度的依賴是平方關(guān)系，一旦入射光波前形變,，不僅聚焦強(qiáng)度大幅下降,，成像分辨率也急劇惡化。因此,，如何解決像差問題,，實(shí)現(xiàn)，例如小鼠大腦皮層,，深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中相當(dāng)有挑戰(zhàn)性的問題之一,。于雙光子激發(fā)需要兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá)，因此只有在焦點(diǎn)附近的樣品區(qū)域才會(huì)激發(fā),，從而實(shí)現(xiàn)三維成像和高分辨率,。進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡原理

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度,，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長(zhǎng)),。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì)，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對(duì)生物樣品損傷更小。國外熒光激光雙光子顯微鏡成像技術(shù)雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布、細(xì)胞活動(dòng)等,。

通過對(duì)微型光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計(jì),，F(xiàn)HIRM-TPM2.0成像視野擴(kuò)大至420×420平方微米，微型物鏡的工作距離擴(kuò)展至1毫米,，以實(shí)現(xiàn)非侵入式成像,；嵌入了可拆卸的快速軸向掃描模塊，實(shí)現(xiàn)了180微米深度的三維體成像和多平面快速切換的實(shí)時(shí)成像,。該模塊由一個(gè)快速的電動(dòng)變焦透鏡和一對(duì)中繼透鏡組成,，在不同深度成像時(shí)保持放大倍率恒定,。其中，變焦模塊重量1.8克,，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸,。此外，新版微型化成像探頭還可整體即時(shí)拔插,，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作,，避免了長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)動(dòng)物的干擾,。在重復(fù)裝卸探頭追蹤同一批神經(jīng)元時(shí),，視場(chǎng)旋轉(zhuǎn)角小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米,。

其實(shí)電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或意義不在于放大倍數(shù),，而在于超高的分辨率。這兩者是不同的,。一般來說,，觀察時(shí)，除了放大物體外,，還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開來,。如果兩個(gè)相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下，即使放大很大程度,，也可能看到兩個(gè)相交的亮點(diǎn)(艾里斑),，沒有明顯的邊界(更不用說細(xì)節(jié)了)，說明分辨率不夠,。沒有分辨率談放大是沒有意義的,。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限，大約是光波波長(zhǎng)的一半,。通常稱之為光學(xué)顯微鏡的放大極限,，但準(zhǔn)確的說應(yīng)該叫分辨率極限。原因是光的衍射,，根本原因是光的波粒二象性,。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的,。電子顯微鏡也有很多種,，被攝體像REM。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡,，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM),。兩者主要用于觀察晶體，根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像,，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實(shí)空間,，即可得到真實(shí)的晶體表面像,。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長(zhǎng)),。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì)，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對(duì)生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊,。科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng)，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡,，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器,。國外雙光子顯微鏡廠家

雙光子顯微鏡還可以對(duì)一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),，還有一些短波長(zhǎng)可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)。進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡原理

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化,。結(jié)合其特點(diǎn)，大致可以分為兩個(gè)方面:深入和主動(dòng)改進(jìn),。為了使激發(fā)激光進(jìn)入更深的層次,，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個(gè)方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化，我們可以把激光束做得更細(xì),，集中能量,，讓激光穿透得更深。對(duì)于樣品,，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素,。為了解決這個(gè)問題，我們需要將樣本透明化,。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本,，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是通過電泳電解脂類,，從而提高標(biāo)本的“透明度”,。進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡原理