配合雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后,，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點產(chǎn)生的熒光再次穿過物鏡，被光探頭接收,，從而達到逐點掃描的效果,。雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升,。ultima雙光子顯微鏡分辨率

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù)，早在20多年前就有了,，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。幾年前雙光子**過期后，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計不少于10家以上,。即便如此,，世界上很多實驗室都搭雙光子，自己搭的好處有很多,，首先是便宜,，尤其是實驗室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了。其次是靈活,，可以選擇針對特殊用途的搭配，改動也靈活,。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊伍,，一趟走下來可以把新手帶出來，后期維護也更加自由,。當(dāng)然壞處也不少,，首先是操心，特別是第1次搭的時候,，開始要想方案,，后來要解決各種實際問題。其次是花時間,，加上買配件的時間,，比買一臺現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時長。現(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol,，大多是老外寫的，中文的較少,。其實完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的,，尤其是沒有經(jīng)驗的時候，容易走彎路,，多花錢,，也多花時間，再加上雙光子的重要器件都需要從國外購買,，在國內(nèi)買這些東西耗時較長,。因此，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗,，貼出來分享,，希望能幫到想自己動手的實驗室國外雙光子顯微鏡investigator如果已經(jīng)有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺,，只需分光即可,。

在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項《超高時空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所,、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院,、動態(tài)成像中心、生命科學(xué)學(xué)院,、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團隊,，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn),，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰,、穩(wěn)定的圖像,。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3)，并已申請多項,。

雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例,；生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動力學(xué)情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢,。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間,。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點，避免了層與層之間的互相干擾,，較大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度,。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中，它能對樣品進行三維觀察,，其基礎(chǔ)雙光子激發(fā)效應(yīng)也具有極高的應(yīng)用價值,。我們可以相信，隨著科技不斷發(fā)展,，其他技術(shù)的不斷結(jié)合,，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用。于雙光子激發(fā)需要兩個光子同時到達,，因此只有在焦點附近的樣品區(qū)域才會激發(fā),，從而實現(xiàn)三維成像和高分辨率。

雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主提出,，30年后因為有了激光才得到實驗驗證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程，這要求極高的電場強度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬,。聚焦光斑越小，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高,。對于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,。基于以上分析,，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?進口2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動,，所以雙光子成像更清晰,。ultima雙光子顯微鏡分辨率

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時,，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。ultima雙光子顯微鏡分辨率