雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高,，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，能夠更加安全,。雙光子顯微鏡在多個領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。investigator雙光子顯微鏡圖像對比度

2008年錢永健等人由于熒光蛋白（GFP,，綠色熒光蛋白）的發(fā)現(xiàn)和使用,，獲得了諾貝爾化學(xué)獎，是對熒光成像技術(shù)的一次巨大肯定和推動,。與熒光蛋白以及熒光染料等標(biāo)記物在細(xì)胞中的定位與表達(dá)技術(shù)相結(jié)合,，使得科學(xué)家可以特異性的分辨生物體乃至細(xì)胞內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)與成分，并且能夠在生命體和細(xì)胞仍具有活性的狀態(tài)下（狀態(tài)）對其功能進(jìn)行動態(tài)觀察,。這就使得熒光成像技術(shù)成為了無可替代的,，生物學(xué)家現(xiàn)今較為重要的技術(shù)手段之一。目前，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)和生理學(xué)研究主要還是在離體培養(yǎng)的細(xì)胞體系中研究,。然而與細(xì)胞生物學(xué)研究有所不同的是,，大腦的功能研究的整體性和原位性顯得更加關(guān)鍵：只研究分離的神經(jīng)元無法解釋神經(jīng)系統(tǒng)的功能和規(guī)律。由于被觀測的信號會受到樣本組織的散射和吸收,，根本無法穿透如此深的組織進(jìn)行成像,。而雙光子顯微鏡（Two-photonMicroscopy，簡稱TPM）的發(fā)明,，則為此類研究帶來了希望,。investigator雙光子顯微鏡圖像對比度雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收 2 個長波長的光子,。

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí),，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。

由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度,，在我們的實(shí)驗(yàn)中,，時(shí)間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制。盡管在單點(diǎn)掃描系統(tǒng)中,，v2PE激發(fā)會使得空間分辨率提高,，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率，這主要是多聚焦成像和單點(diǎn)掃描技術(shù)之間的差異造成的,。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE,，引入圖像掃描技術(shù)可以進(jìn)一步提高空間分辨率，這種技術(shù)需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實(shí)現(xiàn),。除此之外,，由于可見光區(qū)域的共振效應(yīng)，可能會產(chǎn)生光漂白,，因而為了延長觀察時(shí)間,，系統(tǒng)還需要對激發(fā)強(qiáng)度和曝光時(shí)間做進(jìn)一步優(yōu)化。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。

1.生物組織對紅外光的吸收弱,，對可見光吸收強(qiáng),。類似的，平時(shí)用手電筒照射手指,，會看到手通透紅亮,，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少,。2.生物組織對紅外光的散射弱,。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長λ的四次方。類似的,，早晨的太陽非常紅,，也就是因?yàn)殚L波長的紅光穿透力更強(qiáng)。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強(qiáng),。與單光子顯微鏡（如共聚焦顯微鏡）相比,，雙光子顯微鏡可以使用約二倍波長的激光去激發(fā)熒光團(tuán)。長波長光束散射程度低(RayleighScattering),，所以穿透能力強(qiáng),。雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少？美國激光熒光雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用,。investigator雙光子顯微鏡圖像對比度

雙光子顯微鏡的應(yīng)用由于適合動態(tài)成像,，雙光子顯微鏡一經(jīng)問世便很快應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)、遺傳發(fā)育,、藥物代謝等領(lǐng)域,。雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對***神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度,、細(xì)胞運(yùn)動,、分子相互作用等進(jìn)行直接成像監(jiān)測，而且能夠進(jìn)行光裂解,、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱,。同時(shí)，雙光子顯微鏡能動態(tài)監(jiān)測**在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移,，并可對**治療過程中*細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測和評估,。隨著光學(xué)技術(shù)、熒光探針技術(shù),、計(jì)算機(jī)成像技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微技術(shù)會得到更大提升和更廣的應(yīng)用，未來不僅用于基礎(chǔ)研究,，也將擴(kuò)展到臨床應(yīng)用,。investigator雙光子顯微鏡圖像對比度