新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小,，重只2.2克,，適于佩戴在小動物頭部顱窗上，實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號,。在大型動物上，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測,。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學斷層,、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢,，其橫向分辨率達到0.65μm,，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠優(yōu)于目前領域內(nèi)主導的,、美國腦科學計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡,。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術，成像幀頻已達40Hz（256*256像素）,，同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力,。此外，采用自主設計可傳導920nm飛秒激光的光子晶體光纖,，該系統(tǒng)實現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學領域較廣泛應用的指示神經(jīng)元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用,。同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題,。未來,，與光遺傳學技術的結合，可望在結構與功能成像的同時,，精細地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動,。這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。國內(nèi)熒光激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

在該自適應光學雙光子熒光顯微鏡中,，她們將空間光位相調(diào)制器光學共軛到顯微物鏡的后焦平面,，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制,。同時,，她們用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強度,，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”,。來自所有子區(qū)域光束會在焦點處會聚干涉，通過監(jiān)測焦點激發(fā)的雙光子信號隨時間的變化情況,，并進行傅里葉變換分析,，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量,。對另一半子區(qū)域重復這一測量過程,，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。該方法耗時很短,，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正,，無需復雜的計算，適用于任何標記密度和標記類型的樣品,。更重要的是,，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物,、醫(yī)學問題提供了可行性方案,。國內(nèi)熒光激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，適用于長時間的研究。

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關,，所以關鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小。

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國家重大科研儀器研制專項的一個碩果,。它彰顯了北京大學在生物醫(yī)學成像領域先期布局的前瞻性,，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學科交叉背景和重要技術創(chuàng)新能力的“中國智造”隊伍,。目前,，該研發(fā)團隊正在領銜建設“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學成像”十三五國家重大科技基礎設施，積極參與即將啟動的中國腦科學計劃,?？梢云诖?，微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實現(xiàn)“分析腦、理解腦,、模仿腦”的戰(zhàn)略目標發(fā)揮不可或缺的重要作用雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進行有生命體成像,。

指示劑是如何負載細胞，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法,，且都可以用于體內(nèi)和體外研究,。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個神經(jīng)元中。此方法方便實驗者控制單個神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高,。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負載神經(jīng)元,，觀察對象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導致一些膠質(zhì)細胞也被指示劑所標記,，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標記百分比,，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動作電位相關性的活動。第三種也較為常用,，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑,。（A）單細胞注射法；（B）networkloading法,；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）在深度組織中以較長時間對細胞成像,，雙光子顯微鏡是當前之選。國內(nèi)熒光激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學散射,。國內(nèi)熒光激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)

從雙光子的原理和特點我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點：☆光損傷?。河捎陔p光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對***細胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究,；☆穿透能力強：相對于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收只局限于焦點處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點處,，所以焦點以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學濾波器（共焦***）,，這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16,，較大降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進行成像研究,；國內(nèi)熒光激光雙光子顯微鏡熒光壽命計數(shù)