由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度，在我們的實(shí)驗(yàn)中，時(shí)間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制,。盡管在單點(diǎn)掃描系統(tǒng)中,，v2PE激發(fā)會(huì)使得空間分辨率提高，但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,，這主要是多聚焦成像和單點(diǎn)掃描技術(shù)之間的差異造成的,。由于v2PE的激發(fā)體積小于1PE，引入圖像掃描技術(shù)可以進(jìn)一步提高空間分辨率,，這種技術(shù)需要通過在陣列前引入額外的微透鏡陣列來實(shí)現(xiàn),。除此之外，由于可見光區(qū)域的共振效應(yīng),，可能會(huì)產(chǎn)生光漂白,，因而為了延長觀察時(shí)間，系統(tǒng)還需要對(duì)激發(fā)強(qiáng)度和曝光時(shí)間做進(jìn)一步優(yōu)化,。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?。美國investigator雙光子顯微鏡作用

為了驗(yàn)證動(dòng)物生物樣品的時(shí)間分辨成像能力，本實(shí)驗(yàn)觀察了活海拉細(xì)胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1,，見圖3(a),(c)-(i),。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致，對(duì)比可見v2PE在空間分辨率,、激發(fā)深度級(jí)圖像對(duì)比度較常規(guī)寬場顯微鏡都有所提高,。此外，v2PE可以同時(shí)激發(fā)多個(gè)波長的熒光蛋白,，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子的三維動(dòng)力學(xué)多色成像,。在此基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)對(duì)海拉細(xì)胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進(jìn)行了在體成像,，見圖3(j)-(n),，青色為mTFP1,綠色為EGFP，實(shí)驗(yàn)中兩種熒光蛋白同時(shí)成像,，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號(hào)分離出來,。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡光子躍遷顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡,、共聚焦顯微鏡,、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式。

在深度組織中以較長時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像,，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長波光子激發(fā)熒光,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達(dá)到250到500微米，甚至超過1毫米,。另外，同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā),，所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像,。

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上,，所以其成像是整個(gè)樣品的重疊像,，沒有縱向分辨能力,。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光，分辨率有了本質(zhì)上的提高,，擁有了對(duì)樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,，可以進(jìn)行三維成像,、動(dòng)態(tài)成像等,。然而,，***在濾除雜散光的同時(shí)也將大部分來自焦平面的熒光濾除了，只有很弱的熒光到達(dá)檢測器,。若要提高信號(hào)強(qiáng)度,，需要加大激發(fā)光功率,，這又會(huì)導(dǎo)致對(duì)活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加,。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)，與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學(xué)散射,，其具體優(yōu)勢如下,。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦,。

像差問題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者,。像差會(huì)使光波前發(fā)生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率,，使得很多時(shí)候我們只能“霧里看花”,，更甚者，產(chǎn)生贗像,，或無法獲得有意義的圖像,。像差問題對(duì)雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重，因?yàn)樵谀抢?，熒光信?hào)對(duì)入射光強(qiáng)度的依賴是平方關(guān)系,，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強(qiáng)度大幅下降,，成像分辨率也急劇惡化,。因此，如何解決像差問題,，實(shí)現(xiàn),，例如小鼠大腦皮層，深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中相當(dāng)有挑戰(zhàn)性的問題之一,。這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍,。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?美國investigator雙光子顯微鏡作用

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的,，任何事物都有優(yōu)缺點(diǎn)，何況一臺(tái)儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對(duì)于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝,；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點(diǎn)進(jìn)行掃描，對(duì)樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時(shí)就更容易對(duì)樣品進(jìn)行淬滅,；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個(gè)Z軸的層面，所以對(duì)于空間定點(diǎn)光刺激的實(shí)驗(yàn)定點(diǎn)位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā),，對(duì)于一些特殊激發(fā)波長的實(shí)驗(yàn)，效率非常低,。雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子,；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖寬度只有100飛秒,，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲。美國investigator雙光子顯微鏡作用