光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來，不斷發(fā)展,，促進(jìn)生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn),，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門。同時,，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求,，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代?？茖W(xué)進(jìn)入21世紀(jì),，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細(xì)胞和組織，需要能夠更真實(shí)地探索生命,，在體內(nèi)實(shí)時觀察細(xì)胞的發(fā)生和變化,。此時，雙光子顯微鏡進(jìn)入了科學(xué)家的視野,。在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時,，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?。國?nèi)2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

細(xì)胞內(nèi)鈣離子作為重要的信號分子其作用具有時間性和空間性。當(dāng)個細(xì)胞興奮時,，產(chǎn)生了一個電沖動,，此時，細(xì)胞外的鈣離子流入該細(xì)胞內(nèi),，促使該細(xì)胞分泌神經(jīng)遞質(zhì),，神經(jīng)遞質(zhì)與相鄰的下一級神經(jīng)細(xì)胞膜上的蛋白分子結(jié)合,，促使這一級神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生新的電沖動。以此類推,，神經(jīng)信號便一級一級地傳遞下去,，從而構(gòu)成復(fù)雜的信號體系，終形成學(xué)習(xí),、記憶等大腦的高級功能,。在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，鈣離子同樣扮演著重要的信號分子的角色,。靜息狀態(tài)下大部分神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度約為50-100nM,，而細(xì)胞興奮時鈣離子濃度能瞬間上升10-100倍，增加的鈣離子對于突觸囊泡胞吐釋放神經(jīng)遞質(zhì)的過程必不可少,。眾所周知，只有游離鈣才具有生物學(xué)活性,，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度由鈣離子的內(nèi)外流平衡所決定,，同時也受鈣結(jié)合蛋白的影響。細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流的方式有很多種,，其中包括電壓門控鈣離子通道,、離子型谷氨酰胺受體、煙堿型膽堿能受體（nAChR）和瞬時受體電位C型通道（TRPC）等,。神經(jīng)元鈣成像的原理就是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出來,，以反映神經(jīng)元活性。該方法可以同時觀察多個功能或位置相關(guān)的腦細(xì)胞,。國內(nèi)2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器,。

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應(yīng)波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應(yīng)波長在1000nm-1400nm之間,。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的,，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點(diǎn)：1.生物組織對紅外光的吸收弱,，對可見光吸收強(qiáng),。類似的，平時用手電筒照射手指,，會看到手通透紅亮,，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱,。因?yàn)槿鹄⑸涞膹?qiáng)度反比于波長λ的四次方,。類似的，早晨的太陽非常紅,，也就是因?yàn)殚L波長的紅光穿透力更強(qiáng),。這兩點(diǎn)共同導(dǎo)致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強(qiáng),。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊,。從雙光子到三光子科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用,。

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，這一波段的光對***細(xì)胞和組織的光損傷小,，適用于長時間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對于紫外光,，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小，解決對生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題,；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收只局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處,，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦***）,，這樣就提高了對熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高：由于熒光波長小于入射波長,，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時的1/16，較大降低了散射的干擾,；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性,，所以可以對生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像研究；雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用,；國內(nèi)2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野

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許多生物醫(yī)學(xué)成像方式，無論是單光子(共聚焦)或多光子(雙光子),，都使用激光作為光源,，并需要兼容的熒光染料。熒光染料有自己的激發(fā)波長,，它們可以被單個光子以該激發(fā)波長的光子能量激發(fā)(E=hv=h*c/λ);或者是兩個幾乎同時到達(dá)的光子，但每個光子的能量約為單光子能量的一半,，即雙波長(0.5E->2λ),。前者是單光子顯微鏡原理，后者是雙光子顯微鏡原理,。在對同一種熒光染料進(jìn)行成像時,，雙光子與單光子相比可以使用約兩倍波長，因此雙光子的散射較小(波長較長,，散射較小),，可以更深入地滲透到組織中。國內(nèi)2PPLUS雙光子顯微鏡的成像視野