在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時,，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響,。雙光子顯微鏡放大倍數是多少？美國激光雙光子顯微鏡價格

后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7,、8,、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況，來驗證該光學系統(tǒng)對活細胞長期觀察的適用性,。在觀察期間,，88個焦點以100毫秒的曝光時間，曝光間隔1s照射樣品,，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2,，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑,，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖,，(e)-(h)為相應的相應襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s,，得到相應的(i)-(p),。由圖像可知，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷,，對于實際3D延時成像,，由于焦平面是移動的，所以預期細胞存活時間會更長,，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案,。國外熒光雙光子顯微鏡應用是什么雙光子顯微鏡在多個領域研究中已有許多成功實例,。

系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍寶石激光器出射后,，由一個光學參量振蕩器（OPO）轉化到可見光波段,，產生的可見光脈沖寬度為200fs,重復頻率80MHz，波長在490-750nm范圍內可調諧,。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中,，形成用于熒光激發(fā)的多焦點光束。多焦點光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上,，激發(fā)熒光信號,。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸到陣列圓盤，產生共焦效應,，隔離來自焦平面外的雜散光,。

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米,，甚至超過1毫米,。另外，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā),，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重煥新生,。

單光子顯微技術是成熟的熒光顯微技術，但由于其使用的激發(fā)光波長較短,，成像深度有限,；能量較大,會造成對熒光物質的漂白,光毒性嚴重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細胞成像,。而寬場顯微鏡能夠很好地實現實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應用于活細胞內的實時檢測,，但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現多維成像,。雙光子熒光顯微鏡（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。雙光子顯微成像技術是近些年發(fā)展起來的結合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新型非線性光學成像方法,采用長波激發(fā),，能對組織進行深層次成像,。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm，而水,、血液和固有組織發(fā)色團對這個波段的光吸收率低,，此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品，因此背景第,，光損傷小,，適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術能準確定位細胞內置入的微電極位置,，從而觀察胞體,、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經細胞單個樹突棘中的鈣分布,。如果已經有了飛秒光,，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺，只需分光即可,。國內ultimainvestigator雙光子顯微鏡商家

雙光子顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡較大的不同在于無須使用孔限制光學散射,。美國激光雙光子顯微鏡價格

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強？生物組織在近紅外波段存在兩個窗口,第1個近紅外窗口對應波長在700nm-900nm,第2個近紅外窗口對應波長在1000nm-1400nm之間,。舉例說明就是單晶硅對于可見光幾乎是不透明的,，但是對于紅外波段就像是“水晶”一樣通透性很好了。原因有兩點：1.生物組織對紅外光的吸收弱,，對可見光吸收強,。類似的，平時用手電筒照射手指,，會看到手通透紅亮,，也是由于生物組織對長波長的紅光吸收少。2.生物組織對紅外光的散射弱,。因為瑞利散射的強度反比于波長λ的四次方,。類似的，早晨的太陽非常紅,，也就是因為長波長的紅光穿透力更強,。這兩點共同導致長波長的紅外光比可見光對生物組織的穿透能力強。美國激光雙光子顯微鏡價格