實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對比，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長為521nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU，對直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率,。優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡光刺激

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡，其原理大致是這樣的：首先,，讓我們來看看什么是熒光顯微鏡,。熒光顯微鏡是以紫外線為光源，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料,，使其發(fā)出熒光,。相比普通光學(xué)顯微鏡，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長更短的紫外線,，再將可見光過濾掉,，提高了分辨力率。而當(dāng)被檢物體過厚時(shí),，從不同深度發(fā)出的熒光都會打在物鏡上,，使觀察到的像模糊、發(fā)虛,，無法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu),。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上，增加了激光掃描裝置,，從而解決了上述問題,。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源,，激光束經(jīng)照明孔,，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上,，對標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描,。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測孔時(shí)先聚焦,，然后被光探頭收集,，轉(zhuǎn)化為信號輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。這個(gè)裝置能讓通過探測***的只有焦平面上發(fā)出的熒光,，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時(shí)通過改變物鏡的焦距,，能對不同焦平面進(jìn)行掃描，通過計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無法觀測的三維圖像,。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡光刺激雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測,。

像差問題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者。像差會使光波前發(fā)生形變,，不僅降低成像的信噪比和分辨率,，使得很多時(shí)候我們只能“霧里看花”，更甚者,，產(chǎn)生贗像,，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重,，因?yàn)樵谀抢?，熒光信號對入射光?qiáng)度的依賴是平方關(guān)系，一旦入射光波前形變,，不僅聚焦強(qiáng)度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化,。因此,，如何解決像差問題，實(shí)現(xiàn),，例如小鼠大腦皮層,，深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中相當(dāng)有挑戰(zhàn)性的問題之一。

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子,，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子,；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒,，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦，提高了熒光檢測效率,。雙光子顯微鏡角膜成像,。

為了驗(yàn)證動物生物樣品的時(shí)間分辨成像能力,，本實(shí)驗(yàn)觀察了活海拉細(xì)胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1，見圖3(a),(c)-(i),。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致,，對比可見v2PE在空間分辨率、激發(fā)深度級圖像對比度較常規(guī)寬場顯微鏡都有所提高,。此外,，v2PE可以同時(shí)激發(fā)多個(gè)波長的熒光蛋白，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子的三維動力學(xué)多色成像,。在此基礎(chǔ)上,，實(shí)驗(yàn)對海拉細(xì)胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進(jìn)行了在體成像，見圖3(j)-(n),，青色為mTFP1,綠色為EGFP,，實(shí)驗(yàn)中兩種熒光蛋白同時(shí)成像，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號分離出來,。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像,。國外ultima雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像；進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡光刺激

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作且無需維護(hù)的激光系統(tǒng),。其輸出波長為920nm,，非常適合常規(guī)熒光基團(tuán)（如GFP，eGFP,，Eosin,，GCaMP，CFP,，Calcein或者Venus）的雙光子激發(fā),。能給熒光基團(tuán)提供比較高的峰值功率，常用于神經(jīng)科學(xué)和其他與激光有關(guān)的生物光子學(xué)學(xué)科,。而且其獨(dú)特設(shè)計(jì)（制造簡單且經(jīng)濟(jì)高效的光源）對雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的革新具有潛在的可能,。在雙光子顯微鏡中，峰值功率就是亮度,！如果您希望獲得比較好的圖像亮度,，那么你就需要短脈沖，高功率,，較重要的是需要干凈的時(shí)間脈沖形狀,。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率，較短的脈沖和獨(dú)特的Clean-Pulse技術(shù),，以及具有相對比較高的峰值功率,，使得其在雙光子顯微鏡中可以實(shí)現(xiàn)****的亮度，而不會對樣品造成不必要的加熱,。FemtoFiberultra920交鑰匙,，完全集成的色散補(bǔ)償（可確保樣品處的脈沖較短）,，內(nèi)置的功率控制，操作直觀以及其堅(jiān)固而緊湊的設(shè)計(jì),，使該系統(tǒng)具有極為友好的用戶體驗(yàn),，是非線性顯微鏡應(yīng)用的較好解決方案。例如熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對比機(jī)制,。進(jìn)口investigator雙光子顯微鏡光刺激