雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子,；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域,；因信號(hào)背景比高,，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，能夠更加安全,。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布,、細(xì)胞活動(dòng)等。進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小,，重只2.2克,，適于佩戴在小動(dòng)物頭部顱窗上，實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元,、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào),。在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時(shí)程觀測,。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層,、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢,，其橫向分辨率達(dá)到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺(tái)式雙光子熒光顯微鏡可相媲美,，遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的,、美國腦科學(xué)計(jì)劃重要團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù),，成像幀頻已達(dá)40Hz（256*256像素）,，同時(shí)具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬線的線掃描能力。此外,，采用自主設(shè)計(jì)可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動(dòng)的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用,。同時(shí)采用柔性光纖束進(jìn)行熒光信號(hào)的接收,，解決了動(dòng)物的活動(dòng)和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來,，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合,，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時(shí)，精細(xì)地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動(dòng),。美國熒光雙光子顯微鏡圖像對比度于雙光子激發(fā)需要兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá),，因此只有在焦點(diǎn)附近的樣品區(qū)域才會(huì)激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)三維成像和高分辨率。

像差問題一直困擾著光學(xué)領(lǐng)域的工作者,。像差會(huì)使光波前發(fā)生形變,，不僅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多時(shí)候我們只能“霧里看花”,，更甚者,，產(chǎn)生贗像，或無法獲得有意義的圖像,。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴(yán)重,，因?yàn)樵谀抢铮瑹晒庑盘?hào)對入射光強(qiáng)度的依賴是平方關(guān)系,，一旦入射光波前形變,，不僅聚焦強(qiáng)度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化,。因此,，如何解決像差問題，實(shí)現(xiàn),，例如小鼠大腦皮層,，深層區(qū)域的高質(zhì)量成像成為光學(xué)成像發(fā)展中相當(dāng)有挑戰(zhàn)性的問題之一。

在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中,，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面,，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制,。同時(shí),，她們用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時(shí)調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強(qiáng)度,，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”,。來自所有子區(qū)域光束會(huì)在焦點(diǎn)處會(huì)聚干涉，通過監(jiān)測焦點(diǎn)激發(fā)的雙光子信號(hào)隨時(shí)間的變化情況,，并進(jìn)行傅里葉變換分析,，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻(xiàn)信息，從而可以實(shí)現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量,。對另一半子區(qū)域重復(fù)這一測量過程,，從而獲得整個(gè)入射波前的信息并進(jìn)行校正。該方法耗時(shí)很短,，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正,，無需復(fù)雜的計(jì)算，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類型的樣品,。更重要的是,，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量,。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學(xué)問題提供了可行性方案,。雙光子顯微鏡在多個(gè)領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例,。

高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒，而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫,，這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細(xì)胞，使掃描能更好地進(jìn)行,。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例生物領(lǐng)域：貝爾實(shí)驗(yàn)室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)力學(xué)情形,。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲(chǔ)存擴(kuò)展到三維空間,。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點(diǎn),，避免了層與層之間的互相干擾，極大地提高了數(shù)據(jù)儲(chǔ)存密度,。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn),；國外熒光雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少？進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

新一代微型化雙光子熒光顯微成像系統(tǒng)的成功研制是國家重大科研儀器研制專項(xiàng)的一個(gè)碩果,。它彰顯了北京大學(xué)在生物醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域先期布局的前瞻性,，鍛煉了一支以年輕PI和碩博研究生為主體、具有學(xué)科交叉背景和重要技術(shù)創(chuàng)新能力的“中國智造”隊(duì)伍,。目前,，該研發(fā)團(tuán)隊(duì)正在領(lǐng)銜建設(shè)“多模態(tài)跨尺度生物醫(yī)學(xué)成像”十三五國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施，積極參與即將啟動(dòng)的中國腦科學(xué)計(jì)劃,?？梢云诖⑿突p光子熒光顯微成像系統(tǒng)將為實(shí)現(xiàn)“分析腦,、理解腦,、模仿腦”的戰(zhàn)略目標(biāo)發(fā)揮不可或缺的重要作用進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡光子躍遷