雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域,；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。優(yōu)勢(shì)來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),。熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少

剛好雙光子在這兩點(diǎn)具有很大的優(yōu)勢(shì)在實(shí)際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料,，已經(jīng)有做到mm級(jí)別的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-tissueImaging:ScientificReports:NaturePublishingGroup熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?

指示劑是如何負(fù)載細(xì)胞,，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究,。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個(gè)神經(jīng)元中,。此方法方便實(shí)驗(yàn)者控制單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元,，觀察對(duì)象為一群神經(jīng)元,。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比,，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動(dòng)作電位相關(guān)性的活動(dòng),。第三種也較為常用，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑,。（A）單細(xì)胞注射法,；（B）networkloading法；（C）通過病毒轉(zhuǎn)染使其基因編碼鈣離子指示劑（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）

首先我們來簡(jiǎn)單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù),。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種,，用于激發(fā)樣品的熒光信號(hào)并對(duì)其放大成像。在激光掃描共聚焦顯微鏡中,，樣品焦平面上每一時(shí)刻只有一個(gè)點(diǎn)被激發(fā)光照射,，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射，但通過探測(cè)器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號(hào)能被探測(cè)器接收,。也就是說，每個(gè)時(shí)刻,，只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè),。通過點(diǎn)掃描的方式，一個(gè)個(gè)點(diǎn)的信號(hào)就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像,。不同的是，其采用的激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng),，只有當(dāng)兩個(gè)（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時(shí)轟擊熒光探針的時(shí)候才可能激發(fā)出熒光信號(hào),。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn)，出才會(huì)激發(fā)出熒光,。也就是說,，雙光子顯微鏡中，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè),，并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有,。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。

宇宙,，浩瀚無垠,，在數(shù)百億光年可觀測(cè)的空間里閃爍著上萬億個(gè)星系。人類1400克的大腦,如同一個(gè)小小的宇宙,，包含了百億級(jí)神經(jīng)元和百萬億級(jí)的神經(jīng)突觸,，其結(jié)構(gòu)和功能上極其復(fù)雜而精密的連接，涌現(xiàn)出意識(shí)和思想--大腦小宇宙隱藏著世界上較佳麗較深邃的奧秘,。新千年伊始,，世界科技強(qiáng)國(guó)紛紛啟動(dòng)有史以來比較大規(guī)模的腦科學(xué)研究計(jì)劃，人類探索大腦的波瀾壯闊的歷史畫卷正在展開,。工欲善其事,，必先利其器,。目前,，各國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃的一個(gè)重要方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動(dòng)態(tài)圖譜的研究工具。其中，如何打破尺度壁壘,，整合微觀神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)與大腦整體的活動(dòng)和個(gè)體行為信息,，是領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行光裂解,、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱。國(guó)內(nèi)熒光雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么

雙光子顯微鏡能夠在細(xì)胞甚至是亞細(xì)胞水平上對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),、離子濃度,、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、進(jìn)行直接成像監(jiān)測(cè),。熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少

光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來,，不斷發(fā)展，促進(jìn)生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn),，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門,。同時(shí)，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求,，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代,。科學(xué)進(jìn)入21世紀(jì),，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細(xì)胞和組織,，需要能夠更真實(shí)地探索生命,，在體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的發(fā)生和變化。此時(shí),，雙光子顯微鏡進(jìn)入了科學(xué)家的視野,。在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時(shí),，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少