雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢(shì)在于,，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光,，能夠在層面檢測(cè)極限達(dá)1mm的組織區(qū)域,；因信號(hào)背景比高，而具有更高的對(duì)比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外,、可見(jiàn)光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全,。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,，可以觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布、細(xì)胞活動(dòng)等,。進(jìn)口ultimainvestigator雙光子顯微鏡掃描深度

為了驗(yàn)證動(dòng)物生物樣品的時(shí)間分辨成像能力,，本實(shí)驗(yàn)觀(guān)察了活海拉細(xì)胞高爾基體中的青色熒光蛋白mTFP1，見(jiàn)圖3(a),(c)-(i),。使用的物鏡及尺寸與熒光顆粒成像一致,，對(duì)比可見(jiàn)v2PE在空間分辨率、激發(fā)深度級(jí)圖像對(duì)比度較常規(guī)寬場(chǎng)顯微鏡都有所提高,。此外,，v2PE可以同時(shí)激發(fā)多個(gè)波長(zhǎng)的熒光蛋白，這種技術(shù)還可以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)分子的三維動(dòng)力學(xué)多色成像,。在此基礎(chǔ)上,，實(shí)驗(yàn)對(duì)海拉細(xì)胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進(jìn)行了在體成像，見(jiàn)圖3(j)-(n),，青色為mTFP1,綠色為EGFP,，實(shí)驗(yàn)中兩種熒光蛋白同時(shí)成像，終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號(hào)分離出來(lái),。熒光激光雙光子顯微鏡成像原理雙光子顯微鏡中,，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號(hào)被探測(cè)，并且連焦平面外的熒光信號(hào)也不會(huì)有,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)相比普通的顯微鏡電子顯微鏡可以觀(guān)察尺度更小的東西,，冷凍電鏡更是可以觀(guān)察有活性的生物大分子，而雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)呢,？它能做到什么普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎,？原來(lái)，雙光子顯微鏡可以精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn),、觀(guān)察,！由于電磁波的波長(zhǎng)越短，粒子性越強(qiáng),，受散射影響也就越大,。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光，在增加了激光的穿透性的同時(shí)還減少了對(duì)細(xì)胞的毒性,。除此之外,，因?yàn)橹挥形镧R焦點(diǎn)處能發(fā)生雙光子激發(fā)效應(yīng),，所以?huà)呙璧木_度極高,，也能提高激發(fā)光效率，減少被掃描點(diǎn)之外的熒光物質(zhì)消耗,。

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子,；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒,，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲,。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率,。雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 ,。

雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用有較大的應(yīng)用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)成像,，在亞微米級(jí)成像,，此功能與目前市場(chǎng)上的共聚焦類(lèi)顯微鏡性能類(lèi)似；雙光子顯微成像能夠?qū)崟r(shí),、在體,、原位、無(wú)創(chuàng)地,，根據(jù)不同物質(zhì)組份的光譜特性,，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行生化指標(biāo)成像,，在無(wú)造影劑的前提下,，利用自發(fā)熒光、二次諧波,、熒光獲得活細(xì)胞生化信息,。雙光子顯微鏡技術(shù)在醫(yī)療診斷應(yīng)用中具有巨大的潛力，該領(lǐng)域還未形成標(biāo)準(zhǔn)和體系,，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐,，通過(guò)研究人體基于多光子成像技術(shù)，進(jìn)行細(xì)胞結(jié)構(gòu),、生化成分,、微環(huán)境、組織形態(tài),、代謝功能的影響信息,，找到與疾病的細(xì)胞學(xué),、分子生物學(xué)、組織病理學(xué),、診斷和***特征的關(guān)聯(lián)關(guān)系,，共同探究生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，篩選鑒定**,、皮膚病,、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù)，建立全新的多光子細(xì)胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫(kù),，定義出針對(duì)不同疾病的多光子臨床檢測(cè)設(shè)備的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn),。雙光子顯微鏡結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡。熒光激光雙光子顯微鏡成像原理

雙光子顯微鏡廠(chǎng)家就找滔博生物,。進(jìn)口ultimainvestigator雙光子顯微鏡掃描深度

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子激發(fā)技術(shù)和激光掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的：首先，讓我們來(lái)看看什么是熒光顯微鏡,。熒光顯微鏡是以紫外線(xiàn)為光源,，照射被檢物體上的熒光物質(zhì)或是熒光染料，使其發(fā)出熒光,。相比普通光學(xué)顯微鏡,，熒光顯微鏡運(yùn)用了波長(zhǎng)更短的紫外線(xiàn)，再將可見(jiàn)光過(guò)濾掉,，提高了分辨力率,。而當(dāng)被檢物體過(guò)厚時(shí)，從不同深度發(fā)出的熒光都會(huì)打在物鏡上,，使觀(guān)察到的像模糊,、發(fā)虛，無(wú)法清楚的知道被檢物體的結(jié)構(gòu),。而激光掃描共聚顯微鏡就是在熒光顯微鏡的基礎(chǔ)上,，增加了激光掃描裝置，從而解決了上述問(wèn)題,。激光共聚掃描顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場(chǎng)光源和局部平面成像模式,，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明孔,，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡,，并聚焦于樣品上，對(duì)標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描,。組織樣品中的熒光物質(zhì)受到刺激后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡,，通過(guò)探測(cè)孔時(shí)先聚焦，然后被光探頭收集，轉(zhuǎn)化為信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理,。這個(gè)裝置能讓通過(guò)探測(cè)***的只有焦平面上發(fā)出的熒光，使成像更為清晰準(zhǔn)確,，同時(shí)通過(guò)改變物鏡的焦距,，能對(duì)不同焦平面進(jìn)行掃描，通過(guò)計(jì)算機(jī)繪出普通顯微鏡無(wú)法觀(guān)測(cè)的三維圖像,。進(jìn)口ultimainvestigator雙光子顯微鏡掃描深度