首先我們來簡單介紹一下激光掃描共聚焦和雙光子這兩種當(dāng)紅的顯微成像技術(shù),。激光掃描共聚焦顯微技術(shù),，是熒光顯微成像的一種,，用于激發(fā)樣品的熒光信號并對其放大成像,。在激光掃描共聚焦顯微鏡中，樣品焦平面上每一時刻只有一個點(diǎn)被激發(fā)光照射,，縱然焦平面外也有激發(fā)光照射,，但通過探測器前的（pinhole）,，有焦平面上的熒光信號能被探測器接收,。也就是說，每個時刻,，只有焦平面上一個點(diǎn)的信號被探測,。通過點(diǎn)掃描的方式，一個個點(diǎn)的信號就可以組合出終的圖像,。雙光子顯微鏡（包括多光子顯微鏡）同樣采用點(diǎn)掃描的方式得到圖像,。不同的是，其采用的激發(fā)光波長較長,，只有當(dāng)兩個（或更多）激發(fā)光光子幾乎同時轟擊熒光探針的時候才可能激發(fā)出熒光信號,。所以只有在光子密度特別大的焦點(diǎn)，出才會激發(fā)出熒光,。也就是說,，雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點(diǎn)的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有,。由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，適用于長時間的研究。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡廠家

1990年初,，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時,，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用,。當(dāng)時,，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,，換言之,，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實(shí)驗,。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實(shí)驗搭建,，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。國內(nèi)雙光子顯微鏡ultima雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例,。

實(shí)驗從理論和實(shí)驗上評估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率,，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對比，實(shí)驗中v2PE的激發(fā)波長為521nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡,，尺寸為0.6AU，對直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像,。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率,，模擬計算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率,。

光學(xué)顯微鏡從1590年發(fā)明以來，不斷發(fā)展,，促進(jìn)生命科學(xué)日新月異的發(fā)現(xiàn),，幫助人類逐層打開生命本質(zhì)的大門。同時,，生命科學(xué)的發(fā)展不斷給光學(xué)顯微鏡提出新的要求,，促使成像理論和技術(shù)持續(xù)更新迭代,。科學(xué)進(jìn)入21世紀(jì),，人們已經(jīng)不滿足于在體外研究細(xì)胞和組織,，需要能夠更真實(shí)地探索生命，在體內(nèi)實(shí)時觀察細(xì)胞的發(fā)生和變化,。此時,，雙光子顯微鏡進(jìn)入了科學(xué)家的視野。在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時,，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光,，是通過物鏡匯聚的,。

雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)？因為組織對可見光區(qū)域的較強(qiáng)吸收和散射帶來兩個嚴(yán)重的問題第1個是激發(fā)光的減弱,，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性,，單光子激發(fā)的背景較強(qiáng)，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率因為組織對可見光區(qū)域的較強(qiáng)吸收和散射帶來兩個嚴(yán)重的問題第1個是激發(fā)光的減弱,，第2個就是另外就是由于物鏡本身光的光學(xué)特性,，單光子激發(fā)的背景較強(qiáng)，所以才有共聚焦系統(tǒng)提高成像的分辨率剛好雙光子在這兩點(diǎn)具有很大的優(yōu)勢上面的內(nèi)容基本在談到雙光子優(yōu)勢都會相對說明,，在實(shí)際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大,，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍,。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡廠家

成像平臺倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備,。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡廠家

其實(shí)電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢或意義不在于放大倍數(shù),，而在于超高的分辨率,。這兩者是不同的。一般來說,，觀察時,，除了放大物體外，還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開來,。如果兩個相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下,，即使放大很大程度,，也可能看到兩個相交的亮點(diǎn)(艾里斑)，沒有明顯的邊界(更不用說細(xì)節(jié)了),，說明分辨率不夠,。沒有分辨率談放大是沒有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,，大約是光波波長的一半,。通常稱之為光學(xué)顯微鏡的放大極限，但準(zhǔn)確的說應(yīng)該叫分辨率極限,。原因是光的衍射,，根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實(shí)驗證明了電子的波動性,，所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的,。電子顯微鏡也有很多種，被攝體像REM,。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡,，如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體,，根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像,，借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實(shí)空間，即可得到真實(shí)的晶體表面像,。進(jìn)口2PPLUS雙光子顯微鏡廠家