雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子,，經(jīng)過(guò)短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后，發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子,；效果和用波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度,，紅外光可以在平面上探測(cè)到極限為1mm的組織區(qū)域,；因?yàn)樾盘?hào)背景比高，所以具有更高的對(duì)比度,；由于激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)、光毒性小的特點(diǎn),；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，更加安全,。由于其非侵入性和高分辨率的特點(diǎn),，雙光子顯微鏡成為了研究神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究,、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要工具,。美國(guó)布魯克雙光子顯微鏡熒光探測(cè)

實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評(píng)估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對(duì)比,，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長(zhǎng)為521nm,，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU,，對(duì)直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測(cè)試性成像,，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm,，這些值接近顯微鏡的理論分辨率,。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似,，軸向的半高寬較1PE減少,，可以提高空間分辨率。進(jìn)口ultimainvestigator雙光子顯微鏡光子躍遷雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像,；

雙光子顯微成像技術(shù)不是什么新技術(shù),，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學(xué)和材料科學(xué)中廣泛應(yīng)用,。幾年前雙光子**過(guò)期后,，已經(jīng)推出自己的雙光子顯微鏡的廠家估計(jì)不少于10家以上。即便如此,，世界上很多實(shí)驗(yàn)室都搭雙光子,，自己搭的好處有很多，首先是便宜,，尤其是實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)有飛秒激光器,，那就更很省錢了。其次是靈活,，可以選擇針對(duì)特殊用途的搭配,，改動(dòng)也靈活,。結(jié)束后的好處就是可以鍛煉隊(duì)伍，一趟走下來(lái)可以把新手帶出來(lái),，后期維護(hù)也更加自由,。當(dāng)然壞處也不少，首先是操心,，特別是第1次搭的時(shí)候,，開始要想方案，后來(lái)要解決各種實(shí)際問(wèn)題,。其次是花時(shí)間,，加上買配件的時(shí)間，比買一臺(tái)現(xiàn)成的商業(yè)化雙光子耗時(shí)長(zhǎng)?，F(xiàn)在已經(jīng)有不少關(guān)于如何搭雙光子顯微鏡的文章,，各種protocol，大多是老外寫的,，中文的較少,。其實(shí)完全自己搭一套好用的系統(tǒng)還是不容易的，尤其是沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的時(shí)候,，容易走彎路,，多花錢，也多花時(shí)間,，再加上雙光子的重要器件都需要從國(guó)外購(gòu)買,，在國(guó)內(nèi)買這些東西耗時(shí)較長(zhǎng)。因此,，我想總結(jié)一下我們的經(jīng)驗(yàn),，貼出來(lái)分享，希望能幫到想自己動(dòng)手的實(shí)驗(yàn)室

系統(tǒng)示意圖如圖1所示,，紅外激光束從藍(lán)寶石激光器出射后,，由一個(gè)光學(xué)參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200fs,重復(fù)頻率80MHz,，波長(zhǎng)在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧,。光束通過(guò)透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中，形成用于熒光激發(fā)的多焦點(diǎn)光束,。多焦點(diǎn)光束通過(guò)一個(gè)硅油浸潤(rùn)的物鏡成像到樣品上,，激發(fā)熒光信號(hào)。熒光信號(hào)由同一個(gè)物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤,，產(chǎn)生共焦效應(yīng),，隔離來(lái)自焦平面外的雜散光。雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。

配合雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢,？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子使電子躍遷到較高能級(jí)，經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的時(shí)間后,，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子（P=h/λ）。利用這個(gè)原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù),。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖激光，通過(guò)物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光,，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過(guò)物鏡，被光探頭接收,，從而能夠達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果,。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學(xué)操縱,。國(guó)外布魯克雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

雙光子顯微鏡品牌有哪些,？美國(guó)布魯克雙光子顯微鏡熒光探測(cè)

第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時(shí)具備三維成像能力,，獲取了小鼠在自由運(yùn)動(dòng)行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動(dòng)態(tài)功能圖像，并且實(shí)現(xiàn)了針對(duì)同一批神經(jīng)元長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月的追蹤記錄,。在一批“早鳥項(xiàng)目”中,，該系統(tǒng)已被多個(gè)研究組應(yīng)用于不同的模式動(dòng)物和行為范式，如小鼠的社交新穎性識(shí)別,、斑胸草雀受調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化,、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項(xiàng)研究。美國(guó)布魯克雙光子顯微鏡熒光探測(cè)