雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高,，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，使其能夠更加安全,。這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍,。國內(nèi)激光雙光子顯微鏡最大分辨率

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化,。結(jié)合其特點,，大致可以分為兩個方面:深入和主動改進,。為了使激發(fā)激光進入更深的層次,，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個方面入手。關(guān)于器件的優(yōu)化,，我們可以把激光束做得更細,，集中能量，讓激光穿透得更深,。對于樣品,，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素。為了解決這個問題,，我們需要將樣本透明化,。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解,。另一種方法是通過電泳電解脂類,，從而提高標(biāo)本的“透明度”。國外ultimainvestigator雙光子顯微鏡價格雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?

從雙光子的原理和特點,，我們可以清楚地得出雙光子的優(yōu)點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，因此該波段的光對細胞和組織的光損傷很小，適合長期研究,；☆穿透能力強:與紫外光相比,，可見光和近紅外光的穿透能力更強，因此受生物組織散射的影響更小,，解決了生物組織深層物質(zhì)的層析成像問題,；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小，只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)熒光,，雙光子吸收被限制在焦點處體積約為波長三次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點處，焦點外的區(qū)域不會發(fā)生光漂白,；☆熒光收集率高:與共焦成像相比,，雙光子成像不需要濾光片(共焦)，提高了熒光收集率,，直接導(dǎo)致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長，瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲*為單光子激發(fā)產(chǎn)生的1/16,，減少了散射的干擾,；光子躍遷具有很強的選擇性激發(fā),，因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質(zhì)進行成像；

在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）,。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光,；而在雙光子激發(fā)時,，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，為了不損傷細胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響,。雙光子顯微鏡工作原理是利用兩個光子的能量相加達到熒光激發(fā)能量閾值，來激發(fā)樣品中熒光分子發(fā)出熒光信號,。

使用雙光子顯微鏡可以以亞細胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動,，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦,。國內(nèi)熒光雙光子顯微鏡

雙光子顯微鏡的原理是什么？國內(nèi)激光雙光子顯微鏡最大分辨率

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