在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項(xiàng)《超高時(shí)空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所,、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院,、動態(tài)成像中心、生命科學(xué)學(xué)院,、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團(tuán)隊(duì),，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動清晰,、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3),，并已申請多項(xiàng),。于雙光子激發(fā)需要兩個(gè)光子同時(shí)到達(dá)，因此只有在焦點(diǎn)附近的樣品區(qū)域才會激發(fā),，從而實(shí)現(xiàn)三維成像和高分辨率,。美國熒光激光雙光子顯微鏡商家

第二代微型化雙光子熒光顯微鏡FHIRM-TPM2.0，其成像視野是該團(tuán)隊(duì)于2017年發(fā)布的代微型化顯微鏡的7.8倍,，同時(shí)具備三維成像能力,，獲取了小鼠在自由運(yùn)動行為中大腦三維區(qū)域內(nèi)上千個(gè)神經(jīng)元清晰穩(wěn)定的動態(tài)功能圖像，并且實(shí)現(xiàn)了針對同一批神經(jīng)元長達(dá)一個(gè)月的追蹤記錄。在一批“早鳥項(xiàng)目”中,，該系統(tǒng)已被多個(gè)研究組應(yīng)用于不同的模式動物和行為范式,，如小鼠的社交新穎性識別、斑胸草雀受調(diào)控后大腦特定神經(jīng)元變化,、新型神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿探針的傳導(dǎo)適應(yīng)性分析以及獼猴三腦區(qū)成像等多項(xiàng)研究,。進(jìn)口ultima2PPLUS雙光子顯微鏡圖像對比度優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)。

通過并行化不同激光波長的激光掃描,，研究人員增加了在相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積,，同時(shí)保持了高的時(shí)間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號熒光探針,，將神經(jīng)元群體的活動標(biāo)記為兩種不同的顏色,，同時(shí)激發(fā)兩種不同波長的探針，從而實(shí)現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄,。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像,，研究人員還在兩個(gè)激光束上配置了快速變焦系統(tǒng)，即一個(gè)電透鏡和一個(gè)空間光調(diào)制器,。因此,，可以以10Hz的速度同時(shí)記錄10個(gè)500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度,，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu),，體積內(nèi)可以記錄2000多個(gè)神經(jīng)元。

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子，在經(jīng)過一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,，發(fā)射出一個(gè)波長較短的光子,；其效果和使用一個(gè)波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高,，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小,，具有定點(diǎn)激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，使其能夠更加安全,。顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡,、共聚焦顯微鏡,、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式。

基因編碼的熒光探針可用于在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號,，這是揭示動物神經(jīng)活動復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵,。雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動,。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動,，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快了。目前,，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實(shí)現(xiàn),，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像,。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化,，需要將成像速率提高2PM,。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時(shí)間延遲的聚焦陣列,。然后,，該模塊被集成到一個(gè)帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器,。FACED模塊可以產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，脈沖時(shí)間間隔為2ns,。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,。虛光源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小,。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率,。雙光子顯微鏡能夠進(jìn)行指標(biāo)成像,；國外熒光雙光子顯微鏡圖像對比度

雙光子顯微鏡中，同樣每個(gè)時(shí)刻只有焦平面上一個(gè)點(diǎn)的信號被探測,，并且連焦平面外的熒光信號也不會有,。美國熒光激光雙光子顯微鏡商家

臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報(bào)告,。學(xué)術(shù)報(bào)告由臨研所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究平臺潘琳老師主持,。王愛民,，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士,、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”,。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時(shí)病理,、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新型的影像手段和分析方法,。美國熒光激光雙光子顯微鏡商家