從雙光子到三光子：科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升,。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡成像技術(shù)

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn),，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個(gè)問題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理,。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解,。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本的“透明度”提高,。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡成像技術(shù)雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像,。

在國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制專項(xiàng)《超高時(shí)空分辨微型化雙光子在體顯微成像系統(tǒng)》的支持下，北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所,、信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院,、動(dòng)態(tài)成像中心、生命科學(xué)學(xué)院,、工學(xué)院聯(lián)合中國人民醫(yī)學(xué)科學(xué)院組成跨學(xué)科團(tuán)隊(duì),，歷經(jīng)三年多的協(xié)同奮戰(zhàn)，成功研制新一代高速分辨微型化雙光子熒光顯微鏡,，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸活動(dòng)清晰,、穩(wěn)定的圖像。原始論文于5月29日在線發(fā)表于自然雜志子刊NatureMethods(IF25.3),，并已申請多項(xiàng),。

雙光子技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷方面有著巨大的應(yīng)用潛力。這方面沒有標(biāo)準(zhǔn)和體系,，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究和龐大的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)支撐,。通過基于多光子成像技術(shù)研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分,、微環(huán)境,、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息,，可以發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞學(xué),、分子生物學(xué)、組織病理學(xué),、疾病的診斷和特征的關(guān)系,。共同探索生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，篩選皮膚病,、自身免疫性疾病等疑難疾病的識(shí)別,、診斷和鑒別診斷依據(jù)，建立全新完整的多光子細(xì)胞診斷數(shù)據(jù)庫,，明確不同疾病的多光子臨床檢測設(shè)備產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn),。在討論環(huán)節(jié)，來自病理科,、呼吸中心,、心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、皮膚科,、研究所的多位醫(yī)生和科研人員結(jié)合各自的工作領(lǐng)域,，與王愛民副教授進(jìn)行了熱烈的討論。其中,，毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任擬再次邀請王愛民副教授進(jìn)行學(xué)術(shù)交流,。通過此次學(xué)術(shù)交流，病理學(xué)系和研究所分別與王愛民副教授課題組達(dá)成了初步合作意向,。雙光子顯微鏡不需要共聚焦細(xì)孔，提高了熒光檢測效率,。

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強(qiáng)度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對(duì)生物樣品損傷更小。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。進(jìn)口ultima雙光子顯微鏡

上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦,。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡成像技術(shù)

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡,。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行,，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長,，大約在1.3和1.7微米,，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米,，人類大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。進(jìn)口激光熒光雙光子顯微鏡成像技術(shù)