配合了雙光子激發(fā)技術(shù),，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,，被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點,、有生命體的觀察,！美國investigator雙光子顯微鏡分辨率

從雙光子的原理和特點，我們可以清楚地得出雙光子的優(yōu)點:☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，因此該波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷很小,，適合長期研究；☆穿透能力強(qiáng):與紫外光相比,，可見光和近紅外光的穿透能力更強(qiáng),，因此受生物組織散射的影響更小，解決了生物組織深層物質(zhì)的層析成像問題,；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小,，只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)熒光，雙光子吸收被限制在焦點處體積約為波長三次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點處,，焦點外的區(qū)域不會發(fā)生光漂白；☆熒光收集率高:與共焦成像相比,，雙光子成像不需要濾光片(共焦),，提高了熒光收集率，直接導(dǎo)致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長,，瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲*為單光子激發(fā)產(chǎn)生的1/16，減少了散射的干擾；光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇性激發(fā),，因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像,；國外2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)公司雙光子顯微鏡使用的是高能量鎖模脈沖器。

使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,，從而測量不透明大腦深處的活動；成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動,，但神經(jīng)元活動的速度對于常規(guī)的2PM來說太快,。目前電壓成像主要通過寬場顯微鏡實現(xiàn)，但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度,。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對膜電壓變化進(jìn)行成像,，需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點陣列,。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示,。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點，其脈沖時間間隔為2ns,。這些焦點是虛擬源的圖像,，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點越小,。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,，y軸的橫向分辨率為0.35μm,。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深,。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個問題,，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理,。一種方法是運用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標(biāo)本的“透明度”提高,。雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用，可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白質(zhì)分布,、細(xì)胞活動等。

雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù),，可以在保持細(xì)胞活性的情況下,，對深層組織進(jìn)行高分辨率成像。它主要用于生物學(xué),、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究,。雙光子顯微鏡的重心技術(shù)是基于雙光子激發(fā)的熒光成像。當(dāng)激光通過樣品時,，它會吸收特定波長的光子,，然后發(fā)出熒光。雙光子顯微鏡使用兩個連續(xù)的光子同時激發(fā)樣品,，這樣可以在保持樣品完整性的同時,，獲得高質(zhì)量的圖像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點：1.高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性,，它可以獲得比傳統(tǒng)顯微鏡更高的分辨率,。2.深層成像：由于激光的穿透深度限制，傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡無法對深層組織進(jìn)行成像,。而雙光子顯微鏡可以解決這個問題,，因為它可以激發(fā)樣品的深層熒光。3.活細(xì)胞成像：雙光子顯微鏡可以在保持細(xì)胞活性的情況下進(jìn)行成像,，這對于研究細(xì)胞生理學(xué)和生物化學(xué)過程非常有用,。4.多模式成像：雙光子顯微鏡可以結(jié)合多種技術(shù)，如光譜成像,、鈣離子成像和神經(jīng)活動成像等,，以提供更豐富的生物樣品信息?？傊?，雙光子顯微鏡是一種強(qiáng)大的研究工具，可以對深層組織和活細(xì)胞進(jìn)行無損成像,。這使得它在生物學(xué),、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究中具有廣泛的應(yīng)用。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。美國investigator雙光子顯微鏡分辨率

顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡,、寬場熒光顯微鏡,、共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式,。美國investigator雙光子顯微鏡分辨率

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子,，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,，發(fā)射一個波長較短的光子；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的,。雙(多)光子成像的優(yōu)點是具有更深的組織穿透深度,，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域,；因為信號背景比高,，所以具有更高的對比度；由于激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā),、光毒性小的特點；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，更加安全。美國investigator雙光子顯微鏡分辨率