共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像，是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢,？答案是否定的,，任何事物都有優(yōu)缺點，何況一臺儀器呢,，共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢：1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,，對于厚的或者樣品不能進(jìn)拍攝；2.共聚焦顯微鏡由于是逐點進(jìn)行掃描,，對樣品的光毒性還是比較大的,，特別是拍攝活細(xì)胞樣品時就更容易對樣品進(jìn)行淬滅；3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,，所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確,；并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進(jìn)行激發(fā)，對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,，效率非常低,。雙光子顯微鏡還可以對一些具有特性的染料細(xì)胞進(jìn)行實驗，還有一些短波長可以利用雙光子特性進(jìn)行特定實驗,。雙光子顯微鏡原理

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點,，大致可以分成深和活兩方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理,。一種方法是運用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標(biāo)本“透明度”提高,。雙光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡可以進(jìn)行厚的組織樣品拍攝。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,，發(fā)射一個波長較短的光子,；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點是具有更深的組織穿透深度,，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域,；因為信號背景比高，所以具有更高的對比度,；由于激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)、光毒性小的特點,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，更加安全,。

摻雜可以明顯影響碳點（CDs）的發(fā)射和激發(fā)特性,，使雙光子碳點（TP-CDs）具有本征雙光子激發(fā)特性和605nm的紅光發(fā)射特性。在638nm激光照射下,，除了長波激發(fā)和發(fā)射外,，還可以實現(xiàn)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，這為光動力技術(shù)提供了巨大的可能性,。更重要的是,，通過各種表征和理論模擬證實，摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起關(guān)鍵作用,。這種親和力不僅為實現(xiàn)核仁特異性自我靶向提供了可能,，而且通過ROS斷裂RNA鏈解離TP-CDs@RNA復(fù)合物,，賦予治療過程中的熒光變異。TP-CDs結(jié)合了ROS的產(chǎn)生能力,、光動力療法（PDT）過程中的熒光變化,、長波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁的特異性自靶向性，可以認(rèn)為是一種結(jié)合核仁動態(tài)變化實時處理的智能CDs,。雙光子顯微鏡知多少,。

臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告,。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持,。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,，獲學(xué)士、碩士學(xué)位,，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位,。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”,，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,，為未來即時病理、離體組織檢測,、術(shù)中診斷等提供新型的影像手段和分析方法,。雙光子顯微鏡有這么多優(yōu)點，那么雙光子顯微鏡有哪些應(yīng)用呢,？雙光子顯微鏡原理

雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。雙光子顯微鏡原理

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子,，然后發(fā)射出一個波長較短的光子,，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）,，在單光子激發(fā)時,，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時,，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光,。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞,，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。雙光子顯微鏡原理