配合雙光子激發(fā)技術,，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術呢,？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級,，經(jīng)過一個很短的時間后,，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術,。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光,，該點產(chǎn)生的熒光再次穿過物鏡,，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果,。雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 ,。美國激光雙光子顯微鏡成像視野

雙光子技術在醫(yī)療診斷應用中具有巨大的潛力，需要系統(tǒng)的醫(yī)學研究與龐大的醫(yī)療數(shù)據(jù)加以支撐,，通過研究人體基于多光子成像技術,，進行細胞結構、生化成分,、微環(huán)境、組織形態(tài),、代謝功能的影響信息,，找到與疾病的細胞學、分子生物學,、組織病理學,、診斷和特征的關聯(lián)關系，共同探究生理病理基礎和分子細胞生物學機制,，篩選鑒定,、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據(jù),，建立全新的多光子細胞診斷的完整數(shù)據(jù)庫,，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設備的產(chǎn)品標準。討論環(huán)節(jié),，來自病理科,、呼吸中心、心臟科,、神經(jīng)科,、皮膚科及研究所的多位醫(yī)師及研究人員紛紛結合各自的工作領域與王愛民副教授展開了熱烈的討論，其中毛發(fā)中心楊頂權主任計劃再次邀請王愛民副教授進行學術交流,。國內(nèi)布魯克雙光子顯微鏡光損傷雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡,，其原理大致是這樣的；

雙光子熒光顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術,。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高,，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，使其能夠更加安全,。

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器,，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米,。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像,。如果已經(jīng)有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺,，只需分光即可,。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術相結合的新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下,，熒光分子可以同時吸收兩個波長較長的光子,，經(jīng)過短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,，發(fā)射一個波長較短的光子；效果和用波長為長波長一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的,。雙(多)光子成像的優(yōu)點是具有更深的組織穿透深度,，紅外光可以在平面上探測到極限為1mm的組織區(qū)域；因為信號背景比高,，所以具有更高的對比度,；由于激發(fā)體積小，具有定點激發(fā),、光毒性小的特點,；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，更加安全,。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。美國ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像原理

雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為光源,。美國激光雙光子顯微鏡成像視野

隨著技術的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結合它的特點,，大致可以分成深和活兩個方面的提升,。深要想讓激發(fā)激光進入更深的層面，大致可從兩個方面入手,，裝置優(yōu)化與標本改造。關于裝置優(yōu)化,，我們可以把激光束變得更細,，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深,。關于標本,，其中影響光傳播的主要是物質吸收和散射，解決這個問題,，我們需要對樣本進行透明化處理,。一種方法是運用某種物質將標本浸泡，使其中的物質（主要是脂質）被破壞或溶解,。另一種方法是運用電泳將脂質電解,，讓標本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細胞,，所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器,。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖達到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,，而其頻率可以達到80至100兆赫,，這樣即能達到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,，又能不損傷細胞，使掃描能更好地進行,。美國激光雙光子顯微鏡成像視野