雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的,。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光,，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高，而具有更高的對比度,；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性,；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加地安全。雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少,？國外激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣,，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡,。1990年初,，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用,。當時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外,，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子,，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光,。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建,，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。國內(nèi)2PPLUS雙光子顯微鏡圖像對比度對于顯微成像技術(shù)包含：寬場熒光顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡,、雙光子顯微鏡,。

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中，來自標本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上,，所以其成像是整個樣品的重疊像,，沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光,，分辨率有了本質(zhì)上的提高,，擁有了對樣品的特定焦平面精細成像的能力，可以進行三維成像,、動態(tài)成像等,。然而，針空在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,，只有很弱的熒光到達檢測器,。若要提高信號強度，需要加大激發(fā)光功率,，這又會導(dǎo)致對活細胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加,。雙光子顯微鏡蕞大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),，與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學(xué)散射，其具體優(yōu)勢如下所述,。

n摻雜可以明顯影響碳點(CDs)的發(fā)射和激發(fā)特性,，使雙光子碳點(TP-CDs)具有本征雙光子激發(fā)特性和605nm紅光發(fā)射特性。在638nm激光的照射下,，除了長波激發(fā)和發(fā)射外,，還能產(chǎn)生活性氧，這為光動力技術(shù)提供了極大的可能性,。更重要的是,，各種表征和理論模擬證實了摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起著關(guān)鍵作用,。這種親和力不僅可以實現(xiàn)核仁特異性的自我靶向,，還可以通過ROS斷裂RNA鏈來解離TP-CDs@RNA復(fù)合物，從而在治療過程中產(chǎn)生熒光變化,。TP-CDs結(jié)合了ROS產(chǎn)生的能力,、PDT過程中的熒光變化、長波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁特異性自靶向性,，因此可以認為是一種實時處理核仁動態(tài)變化的智能CDs,。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,，發(fā)射出一個波長較短的光子,；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于,，具有更深的組織穿透深度,，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域,；因信號背景比高,，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小,，具有定點激發(fā)的特性,，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外,、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),，使其能夠更加安全。雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測,。2PPLUS雙光子顯微鏡授權(quán)供應(yīng)商

這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍,。國外激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少

雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因為有了激光才得到實驗驗證，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年,。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當于和頻產(chǎn)生非線性過程,，這要求極高的電場強度,，而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄,，雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?；谝陨戏治?，能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標準激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),，所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見光波長),。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠未實現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見光穿透更深,，對生物樣品損傷更小。國外激光熒光雙光子顯微鏡成像視野是多少