雙光子之源：飛秒激光：雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎(jiǎng)得主MariaGoeppertMayer提出,，30年后因?yàn)橛辛思す獠诺玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要了解其中的非線性過(guò)程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過(guò)程,，這要求極高的電場(chǎng)強(qiáng)度,，而電場(chǎng)取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,，脈寬越窄，雙光子吸收效率越高,。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬,?；谝陨戏治觯軌蛞愿咧仡l(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這也再次說(shuō)明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì)：只有焦平面處才能形成雙光子吸收,，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無(wú)法被激發(fā)，所以雙光子成像更清晰,。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬,、630nm可見(jiàn)光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用,。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,，而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深，對(duì)生物樣品損傷更小,。由于其非侵入性和高分辨率的特點(diǎn),，雙光子顯微鏡成為了研究神經(jīng)科學(xué)、ai癥研究,、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要工具,。美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡作用

通過(guò)并行化不同激光波長(zhǎng)的激光掃描，研究人員增加了在相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積,，同時(shí)保持了高的時(shí)間和空間分辨率,。研究人員通過(guò)引入兩種不同波長(zhǎng)的鈣信號(hào)熒光探針，將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩種不同的顏色,，同時(shí)激發(fā)兩種不同波長(zhǎng)的探針,，從而實(shí)現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像,，研究人員還在兩個(gè)激光束上配置了快速變焦系統(tǒng),，即一個(gè)電透鏡和一個(gè)空間光調(diào)制器,。因此,，可以以10Hz的速度同時(shí)記錄10個(gè)500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度,，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu),，體積內(nèi)可以記錄2000多個(gè)神經(jīng)元,。ultima雙光子顯微鏡雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖光，是通過(guò)物鏡匯聚的,。

雙光子熒光顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù),。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子,，經(jīng)過(guò)短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后,，發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；效果和用波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的,。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度,，紅外光可以在平面上探測(cè)到極限為1mm的組織區(qū)域；因?yàn)樾盘?hào)背景比高,，所以具有更高的對(duì)比度,；由于激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā),、光毒性小的特點(diǎn),；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見(jiàn)光調(diào)整為紅外激發(fā),，更加安全,。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見(jiàn)光波長(zhǎng)),。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器,。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見(jiàn)光穿透更深,，對(duì)生物樣品損傷更小,。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊,?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來(lái)也是自然的發(fā)展方向,。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深,，目前記錄約為2.2毫米,，人類(lèi)大腦皮層厚約4毫米,。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,，但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA),。對(duì)于顯微成像技術(shù)包含：寬場(chǎng)熒光顯微鏡,、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡,、雙光子顯微鏡,。

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光，可見(jiàn)光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力,，因而受生物組織散射的影響更小,，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小,，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光,，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處,，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比,，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦）,，這樣就提高了對(duì)熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高,。雙光子顯微鏡的原理是什么,？美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡作用

雙光子顯微鏡還可以對(duì)一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)；美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡作用

雙光子的來(lái)源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎(jiǎng)獲得者M(jìn)ariaGoeppertMayer提出,，并在30年后因?yàn)榧す舛玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，但WinfriedDenk用了近30年才發(fā)明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,，首先要理解非線性過(guò)程,。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生的非線性過(guò)程，需要極高的電場(chǎng)強(qiáng)度,，電場(chǎng)取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小,，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡,，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān),，所以關(guān)鍵變量只有激光脈沖寬度,。基于以上分析,，能夠輸出高重復(fù)率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光已經(jīng)成為雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源,。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì):雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外,，由于光強(qiáng)較低，無(wú)法激發(fā),，所以雙光子成像更清晰,。美國(guó)2PPLUS雙光子顯微鏡作用