基因編碼的熒光探針可用于在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào),，這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵,。雙光子顯微鏡(2PM)可以對鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像,，從而測量不透明腦深部的活動(dòng)。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動(dòng),，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對于常規(guī)的2PM來說太快了,。目前，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實(shí)現(xiàn),，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像,。因此,，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM,。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光,，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時(shí)間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個(gè)帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,，如圖2所示,。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),，脈沖時(shí)間間隔為2ns,。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像。虛光源越遠(yuǎn),，物鏡處的光束尺寸越大,，焦點(diǎn)越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡,，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率,。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收，而焦平面之外由于光強(qiáng)低無法被發(fā)動(dòng),，所以雙光子成像更清晰,。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

從雙光子的原理和特點(diǎn)，我們可以清楚地得出雙光子的優(yōu)點(diǎn):☆光損傷小:由于雙光子顯微鏡采用可見光或近紅外光作為激發(fā)光源,，因此該波段的光對細(xì)胞和組織的光損傷很小,，適合長期研究；☆穿透能力強(qiáng):與紫外光相比,，可見光和近紅外光的穿透能力更強(qiáng),，因此受生物組織散射的影響更小，解決了生物組織深層物質(zhì)的層析成像問題,；☆高分辨率:由于雙光子吸收的截面很小,，只能在焦平面很小的區(qū)域激發(fā)熒光，雙光子吸收被限制在焦點(diǎn)處體積約為波長三次方的范圍內(nèi),；☆漂白區(qū)域小:由于激發(fā)只存在于交點(diǎn)處,，焦點(diǎn)外的區(qū)域不會(huì)發(fā)生光漂白；☆熒光收集率高:與共焦成像相比,，雙光子成像不需要濾光片(共焦),，提高了熒光收集率，直接導(dǎo)致圖像對比度的提高,；☆圖像對比度高:由于熒光波長小于入射波長,，瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲*為單光子激發(fā)產(chǎn)生的1/16，減少了散射的干擾,；光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇性激發(fā),，因此可以用來對生物組織中的一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像；國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡光子躍遷雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少,？

隨著技術(shù)的發(fā)展,，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn),，大致可以分成深和活兩方面的提升,。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手,，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造,。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì),，使能量更加集中,，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,，解決這個(gè)問題，我們需要對樣本進(jìn)行透明化處理,。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,，讓標(biāo)本“透明度”提高,。

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點(diǎn)偶然,，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡,。1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí),，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書,，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí),，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件,，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之,，與其通過一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子,，通過兩個(gè)雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn),。借了一套染料飛秒激光器,，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天,，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了,。在深度組織中以較長時(shí)間對細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能不斷優(yōu)化。結(jié)合其特點(diǎn),，大致可以分為兩個(gè)方面:深入和主動(dòng)改進(jìn),。為了使激發(fā)激光進(jìn)入更深的層次，可以從器件優(yōu)化和標(biāo)本改造兩個(gè)方面入手,。關(guān)于器件的優(yōu)化,，我們可以把激光束做得更細(xì)，集中能量,，讓激光穿透得更深,。對于樣品，物質(zhì)的吸收和散射是影響光傳播的主要因素,。為了解決這個(gè)問題,，我們需要將樣本透明化。一種方法是用某種物質(zhì)浸泡標(biāo)本,，使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解,。另一種方法是通過電泳電解脂類，從而提高標(biāo)本的“透明度”,。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?美國激光熒光雙光子顯微鏡價(jià)位

雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器,。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效,。那么,，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下,，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長波長的光子使電子躍遷到較高能級(jí),，經(jīng)過一個(gè)很短的時(shí)間后，電子再躍遷回低能級(jí)同時(shí)放出一個(gè)波長為長波長一半的光子（P=h/λ）,。利用這個(gè)原理,，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光,，通過物鏡匯聚,，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,，所以只有在焦點(diǎn)處才能發(fā)生雙光子激發(fā),，產(chǎn)生熒光，該點(diǎn)產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡,，從而被光探頭接收,，從而達(dá)到逐點(diǎn)掃描的效果。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡光子躍遷