剛好雙光子在這兩點具有很大的優(yōu)勢在實際操作中成像的深度和樣品的關(guān)系很大，雙光子成像利用高亮度的熒光標(biāo)記材料,，已經(jīng)有做到mm級別的穿透深度HighqualitycellularTPimagingwithhighsignal-to-backgroundratio(>100)andtissueimagingwithapenetrationdepthof2200μmhavebeenachievedwithP-QDasprobe.ExtremelyHighBrightnessfromPolymer-EncapsulatedQuantumDotsforTwo-photonCellularandDeep-tissueImaging:ScientificReports:NaturePublishingGroup雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡成像視野

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是,，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長,，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米,。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像,。國外ultima雙光子顯微鏡應(yīng)用是什么雙光子顯微鏡的原理是什么？

后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7,、8,、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況，來驗證該光學(xué)系統(tǒng)對活細胞長期觀察的適用性,。在觀察期間,，88個焦點以100毫秒的曝光時間，曝光間隔1s照射樣品,，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2,，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑,，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖,，(e)-(h)為相應(yīng)的相應(yīng)襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s,，得到相應(yīng)的(i)-(p),。由圖像可知，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷,，對于實際3D延時成像,，由于焦平面是移動的，所以預(yù)期細胞存活時間會更長,，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案,。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選,。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,，使用探測器測量被激發(fā)的熒光,。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,，通過單光子激發(fā)熒光,，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光,。下面是兩種技術(shù)的對比圖,。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深,。共聚焦的成像深度一般為100微米,，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米,。另外,，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織,，并且生成更清晰的圖像,。雙光子顯微鏡廠家就找因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司；

雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實例,；生物領(lǐng)域：貝爾實驗室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣離子動力學(xué)情形,。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢。信息領(lǐng)域：美國科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲存擴展到三維空間,。由于雙光子激發(fā)具有作用精細體積小的特點,，避免了層與層之間的互相干擾，較大地提高了數(shù)據(jù)儲存密度,。雙光子顯微鏡已延伸到各個領(lǐng)域研究中,，它能對樣品進行三維觀察，其基礎(chǔ)雙光子激發(fā)效應(yīng)也具有極高的應(yīng)用價值,。我們可以相信,，隨著科技不斷發(fā)展，其他技術(shù)的不斷結(jié)合,，雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用,。雙光子顯微鏡能夠在細胞甚至是亞細胞水平上對神經(jīng)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、離子濃度,、細胞運動,、進行直接成像監(jiān)測。國外激光雙光子顯微鏡光子躍遷

雙光子顯微鏡將得到更大的發(fā)展與更廣的應(yīng)用,。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡成像視野

新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小,，重只2.2克，適于佩戴在小動物頭部顱窗上,，實時記錄數(shù)十個神經(jīng)元,、上千個神經(jīng)突觸的動態(tài)信號,。在大型動物上，還可望實現(xiàn)多探頭佩戴,、多顱窗不同腦區(qū)的長時程觀測,。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層,、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢,，其橫向分辨率達到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美,，遠優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的,、美國腦科學(xué)計劃重要團隊所研發(fā)的微型化寬場顯微鏡。采用雙軸對稱高速微機電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù),，成像幀頻已達40Hz（256*256像素）,，同時具備多區(qū)域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力,。此外,，采用自主設(shè)計可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用,。 同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收,，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來,，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合,，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時，精細地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動,。國內(nèi)激光熒光雙光子顯微鏡成像視野