單細胞RNA-seq、RNA-seq和逆轉(zhuǎn)錄qPCR（RT-qPCR）都采用一個共同過程,，即分離RNA并將其轉(zhuǎn)化為cDNA進行分析,。不過,，每種分析在開展方式和獲得的數(shù)據(jù)上有所不同。RNA-seq和RT-qPCR都是先從大量細胞中分離RNA,，然后將其轉(zhuǎn)化為cDNA。RNA-seq是使用cDNA來構(gòu)建新一代測序文庫,，從而測定整個轉(zhuǎn)錄組的基因表達,。RT-qPCR則是從cDNA中擴增特定靶點，并通過熒光測定表達水平,。RT-qPCR限于已知靶點,，而RNA-seq可實現(xiàn)無偏倚的全轉(zhuǎn)錄組基因表達分析。然而,，這兩者只能提供細胞群體內(nèi)基因表達的平均情況,。單細胞RNA-seq則在分離RNA之前將單細胞分離到微孔或單個微反應(yīng)容器中。然后用細胞特異性的條形碼標記RNA,，確保來自每個細胞的cDNA可以追溯到起源細胞,。與RNA-seq相似，帶有條形碼的cDNA也被用于構(gòu)建新一代測序文庫,，從而能夠?qū)γ總€細胞的整個轉(zhuǎn)錄組進行基因表達測定,。全線搭建10X Genomics Chromium Controller單細胞測序平臺。湖州單細胞測序數(shù)據(jù)分析可視化

一味的追求高細胞數(shù)量的捕獲,，小心得不償失,，原因在這：單細胞測序所有的分析都是基于細胞聚類進行，而細胞聚類是在區(qū)分cell和non-cell后,，獲得細胞基因表達譜,，通過降維（pca），無監(jiān)督聚類以及可視化（t-SNE）得到的,。進行細胞聚類時需要考慮到每個細胞的基因表達模式,，因此即使是相同的數(shù)據(jù)，在剔除幾個細胞的情況下,，前后獲得的聚類圖也會出現(xiàn)明顯不同,。而當(dāng)細胞捕獲數(shù)過多時，無論是假陰性和假陽性數(shù)據(jù)還是多細胞數(shù)據(jù),，都會對正常細胞聚類產(chǎn)生影響,，造成聚類結(jié)果失真。這也是很多文章,，特別是很多高分文章,，為什么單個樣本捕獲細胞數(shù)在2000-3000的原因了。烈冰建議單個樣本捕獲細胞數(shù)在3000-5000個時,，數(shù)據(jù)量在100G左右時,，可以滿足分析和文章發(fā)表的多重需求,。南京高通量測序單細胞測序數(shù)據(jù)分析可視化烈冰對于一個細胞群體中的每個細胞單獨進行建庫測序分析。

相對于Smart-Seq技術(shù)在細胞數(shù)量上的問題,，10X平臺普遍提供的細胞數(shù)量都在1000-20000不等的測序細胞量,，這個量級的測序細胞量已經(jīng)可以說能夠完全覆蓋絕大部分組織的Single Cell群體類型。因此,，這兩種技術(shù)對于基于基因表達進行準確細胞分型上,，無論是從細胞數(shù)量上來說還是表達檢測可靠性來說，都會更實用,。同時依托Random Cell Label技術(shù),，使得其對于NovaSeq、HiSeq X Ten,、Hiseq 4000等設(shè)備存在的Index hooping現(xiàn)象,，相對于Smart-Seq數(shù)據(jù)來說，影響幾乎可以忽略不計（10X Genomics官方網(wǎng)站曾給出hooping測試結(jié)果,，顯示無影響,。

樣本制備后的保存 為了盡可能地減少轉(zhuǎn)錄組的變化，在對細胞進行清洗和計數(shù)后,，單細胞懸液應(yīng)當(dāng)保存于冰上,，直至用于后續(xù)的上機和文庫制備步驟。在理想狀況下,，一旦制備好樣本,，應(yīng)當(dāng)在3min鐘內(nèi)將其用于下游步驟。然而,，您還有必要了解各類細胞的不同性質(zhì),，因為這可能會影響細胞應(yīng)在冰上保存的時間，以及它們在制備后多久便應(yīng)當(dāng)被盡快使用,。例如,，有些細胞（如PBMC）如果在冰上放置一段時間，它們就開始形成團塊,。這些團塊很難解離,，增加了堵塞的風(fēng)險，而且每個團塊被當(dāng)成單細胞計數(shù),，又降低了細胞計數(shù)的準確性,。此外，有些細胞更加粘稠,，形成團塊的速度更快,。對于這些細胞，必須盡量減少制備和使用之間的時間差。深度的單細胞測序數(shù)據(jù)解讀助力醫(yī)療健康大時代,。

單細胞測序是指針對單個細胞進行全轉(zhuǎn)錄組測序分析,，可精確地描述每一個細胞的狀態(tài)，在異質(zhì)性發(fā)育過程中具有特殊的應(yīng)用價值,。然而,，單細胞測序無法給出固態(tài)異質(zhì)化組織中細胞空間排布信息，對于揭示發(fā)育過程,、病理微環(huán)境都存在很大的局限性,。空間轉(zhuǎn)錄組測序以點陣形式記錄病理切片細胞的空間信息并進行測序,，可以精確指示點陣內(nèi)的全部基因表達情況?？臻g轉(zhuǎn)錄組測序的加入,，無疑讓單細胞測序如虎添翼，更精確地勾勒了組織水平的異質(zhì)性,。單細胞測序平臺,，烈冰提供高性價比服務(wù)方案。烈冰科技單細胞測序平臺

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細胞計數(shù)和活力評估在評估樣本質(zhì)量時,，需要在細胞清洗和過濾之后測定細胞活力，這一點至關(guān)重要,。測定細胞活力有許多種方法,，烈冰多年單細胞測序經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)臺盼藍法在鑒定活細胞與死細胞的比例時效果很好。細胞計數(shù)的準確性以及目標回收量和實際回收量之間的一致性,，取決于我們了解樣本中有多少個細胞,。一旦過濾和清洗完成，可采用細胞計數(shù)設(shè)備（如血球計數(shù)器或自動細胞計數(shù)儀）進行定量,。這些設(shè)備不但能提供準確的細胞計數(shù),，還能計算出向微流體芯片上樣適量細胞所需的細胞懸液體積。湖州單細胞測序數(shù)據(jù)分析可視化

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