N6-甲基脫氧腺苷(6mA)是原核生物和真核生物的DNA修飾類型之一,，在細(xì)菌、藻類及植物基因組中***存在,，在DNA錯(cuò)配修復(fù),、染色體分離和毒力調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。6mA免疫沉淀測(cè)序(6mA-IPSeq)通過(guò)特異性抗體富集6mA甲基化的DN**段,，然后結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)在全基因組水平上以較小的數(shù)據(jù)量,，快速、高效地尋找6mA甲基化區(qū)域,。技術(shù)優(yōu)勢(shì)全基因組范圍鑒定6mA甲基化修飾區(qū)域技術(shù)方法適合所有物種(一般推薦藻類及植物)科學(xué)方案設(shè)計(jì)從項(xiàng)目背景了解,、協(xié)助方案設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)材料選取,、建庫(kù)測(cè)序,，到數(shù)據(jù)分析每個(gè)項(xiàng)目有特定的科學(xué)問(wèn)題；需要專業(yè),、有價(jià)值的建議,；科學(xué)、縝密的設(shè)計(jì)及時(shí)高效的溝通,；以保障高質(zhì)量研究成果樣本要求：基因組DNA:>=3ug,；樣品濃度>50ng/ul；無(wú)RNA和蛋白污染建庫(kù)測(cè)序：測(cè)序策略：IlluminaHiSeq,PE150,。 基因組DNA冰袋或者干冰運(yùn)輸,。陜西焦磷酸測(cè)序技術(shù)服務(wù)售后分析

相比之下，VeraCode GoldenGate甲基化分析技術(shù)更適合中通量的篩選及驗(yàn)證研究，它以以矩陣微珠芯片(Sentrix Array Matrix(SAM)）形式分析48至384個(gè)用戶指定的CpG位點(diǎn),。首先,，將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA 與分析oligo混合，oligo與未甲基化位點(diǎn)的U互補(bǔ),，或者與甲基化位點(diǎn)的C互補(bǔ),。雜交之后，引物延伸,，并連接上位點(diǎn)特異的oligo來(lái)產(chǎn)生通用 PCR的模板,。***，用標(biāo)記的PCR引物生成可檢測(cè)的產(chǎn)物,。據(jù)Illumina的產(chǎn)品**介紹,，其產(chǎn)品的**優(yōu)勢(shì)在于單個(gè)CpG位點(diǎn)的分辨率。其它分析將甲基化定位在一段區(qū)域,，而通過(guò)Illumina分析,，你能精確測(cè)定某個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平。陜西焦磷酸測(cè)序技術(shù)服務(wù)售后分析WGBS和RRBS都是金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù), CNS發(fā)表文章都很多,，廣發(fā)被接受,。

甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析(MS-HRM)

通過(guò)熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲線的差異，因此DNA樣本經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理后,，甲基化與未甲基化DNA會(huì)存在序列差異,，這種差異可通過(guò)熔解曲線分析來(lái)發(fā)現(xiàn)。使用該方法進(jìn)行甲基化分析*需一對(duì)引物,，相對(duì)簡(jiǎn)單,，不過(guò)這種方法對(duì)儀器的要求頗高，需要帶HRM模塊的熒光定量PCR儀,，并且在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR過(guò)程中,，需要使用飽和的熒光染料。利用MS-HRM技術(shù)進(jìn)行甲基化檢測(cè)只能對(duì)檢測(cè)片段整體甲基化情況進(jìn)行分析,，并不能明確每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),。因此這種技術(shù)適用于大量樣本的檢測(cè)，篩選出感興趣的CPG位點(diǎn),，然后利用其他方法進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)的精確檢測(cè)及甲基化程度的精確定量,。

    重亞硫酸鹽處理結(jié)合測(cè)序是目前檢測(cè)甲基化的金標(biāo)準(zhǔn)。除了全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)等研究手段,，對(duì)于大樣本量甲基化研究來(lái)說(shuō),，更需要靈活、有針對(duì)性的技術(shù)方案,。NGS-BSP方法適合幾個(gè)到幾十個(gè)基因或者位點(diǎn)進(jìn)行大樣本甲基化測(cè)序或者驗(yàn)證項(xiàng)目,，具有更快速的實(shí)驗(yàn)周期及低成本優(yōu)勢(shì),。技術(shù)優(yōu)勢(shì)高效靈活的目標(biāo)區(qū)域甲基化檢測(cè)的工具BSP和高通量測(cè)序完美結(jié)合，單堿基分辨率適合幾個(gè)到幾十個(gè)位點(diǎn)的大樣本驗(yàn)證項(xiàng)目適合所有動(dòng)物樣本,、周期快,、檢測(cè)位點(diǎn)靈活、性價(jià)比高科學(xué)方案設(shè)計(jì)從項(xiàng)目背景了解,、協(xié)助方案設(shè)計(jì),、實(shí)驗(yàn)材料選取、建庫(kù)測(cè)序,，到數(shù)據(jù)分析每個(gè)項(xiàng)目有特定的科學(xué)問(wèn)題,；需要專業(yè)、有價(jià)值的建議,；科學(xué),、縝密的設(shè)計(jì)及時(shí)高效的溝通；以保障高質(zhì)量研究成果樣本要求：基因組DNA:>=1ug(20個(gè)區(qū)域/位點(diǎn)),；樣品濃度>30ng/ul,；無(wú)RNA和蛋白污染建庫(kù)測(cè)序：測(cè)序策略：IlluminaHiSeq,PE150；測(cè)序深度：>,。 提供樣本DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果,。

甲基化特異性PCR（MS-PCR）

DNA在亞硫酸氫鹽作用后，DNA CpG若無(wú)甲基化,，則序列中的C改變?yōu)閁,，若有甲基化則保持不變,，因此從理論上講,，用不同的引物做PCR，即可檢測(cè)出這種差異,，從而確定基因有無(wú)CpG島甲基化,。因此根據(jù)目的基因修飾前后的改變，就可以相應(yīng)設(shè)計(jì)M和U引物,，有時(shí)我們需要設(shè)計(jì)兩輪引物,。

這種方法靈敏度高，無(wú)需特殊儀器,，因此經(jīng)濟(jì)實(shí)用,，是目前應(yīng)用**為***的檢測(cè)方法。不過(guò)也存在一定的局限性,，預(yù)先需要知道待測(cè)片段的DNA序列,，引物的設(shè)計(jì)非常重要。另外,，亞硫酸氫鹽處理也十分關(guān)鍵,，若處理不完全則可能導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn),。 CpG島常位于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近。陜西焦磷酸測(cè)序技術(shù)服務(wù)售后分析

芯片數(shù)據(jù)如何與二代,、三代數(shù)據(jù)整合,。陜西焦磷酸測(cè)序技術(shù)服務(wù)售后分析

    將待測(cè)DNA經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽處理，通過(guò)PCR擴(kuò)增過(guò)程引入T7啟動(dòng)子序列,，經(jīng)T7DNA聚合酶的體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程得到各樣本RNA產(chǎn)物,，經(jīng)堿基特異性酶切處理，得到RNA小片段,，并用飛行質(zhì)譜檢測(cè)每個(gè)片段的分子量,，***EpiTYPER程序完成數(shù)據(jù)的自動(dòng)化處理并報(bào)告每個(gè)檢測(cè)片段的甲基化程度。技術(shù)優(yōu)勢(shì)·檢測(cè)片段長(zhǎng)：擴(kuò)增片段長(zhǎng)度可達(dá)500bp·高靈敏度：可發(fā)現(xiàn)低至5%甲基化水平,，樣本起始量低至10ng,。·重復(fù)性好：變異系數(shù)CV≤5%,?！じ咝詢r(jià)比：用384孔板進(jìn)行PCR反應(yīng)，一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物可以進(jìn)行多重CpG位點(diǎn)分析,，無(wú)需后續(xù)驗(yàn)證,，可直接用于文章發(fā)表。服務(wù)內(nèi)容1.根據(jù)客戶提供的序列信息進(jìn)行預(yù)評(píng)估,；2.進(jìn)行樣本DNA的分離,、純化、質(zhì)檢及亞硫酸鹽修飾,。3.使用特殊設(shè)計(jì)的一對(duì)引物擴(kuò)增樣本,，得到帶有T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。4.在體外轉(zhuǎn)錄體系中,，利用T7RNA聚合酶,，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄為RN**斷。5.利用RNaseA能夠特異性識(shí)別并切割RNA中U3’端的特性,，將RN**斷切割成攜帶有CpG位點(diǎn)的小片斷,。6.使用sequenom®MassArray飛行質(zhì)譜分析系統(tǒng)檢測(cè)產(chǎn)物。由于同一片斷中,，只有CpG和CpA之間16Da的分子量差別,，即質(zhì)譜圖中兩者峰的差距。 陜西焦磷酸測(cè)序技術(shù)服務(wù)售后分析