基因藥物常用的AAV載體有三種生產方法,，分別是三質粒瞬轉體系,、桿狀病毒表達載體體系和包裝細胞體系。其中,，20多年前開發(fā)的三質粒瞬轉表達技術仍然占據腺相關病毒AAV生產的主流地位,，其三質粒分別是Helper質粒（含E2a/b,、E4和VARNA基因）、目標基因表達質粒及輔助質粒（含Cap和Rep基因）,。雖然AAV病毒載體的血清型不同,，但AAV的生產流程基本一致，主要有質粒共轉宿主細胞HEK293,、293細胞生產病毒顆粒,、從細胞培養(yǎng)上清或/及細胞裂解液中收獲病毒載體、純化/制劑/無菌過濾/灌裝等流程,。M-SAN HQ中鹽核酸酶更適合細胞基因drug（如AAV,、LVV、RV及OV等）的生產,。河南M-SAN HQ中鹽核酸酶

一般來說,，生物生產工藝用的核酸酶以BenzonaseTM（BenzonaseTM是Merck的注冊商標）為主，能高效降解任何形式（雙鏈,、單鏈,、線狀、環(huán)狀）的DNA和RNA,。該酶來自于大自然界普遍存在的S.Marcescen,，通過E.coli發(fā)酵生產得到。該酶的適宜反應條件是低鹽濃度范圍（<100mM鹽濃度）,，且酶活隨著鹽濃度上升而下降,，在300mM鹽濃度時酶活幾乎喪失。對于細胞基因藥物常用的兩種病毒載體LV和AAV,，LV由于含有脂包膜結構一般都在生理鹽條件下存在,，而AAV在高鹽條件下不易團聚、更穩(wěn)定,。而在生理鹽濃度及更高濃度條件下,，Benzonase活性受到抑制。山東中鹽核酸酶70950-202M-SAN HQ中鹽核酸酶的檢測標準,，都符合USP-EP要求,。

宿主細胞DNA（HCD）殘留以染色質形式存在，其中有帶負電荷的DNA,、帶正電荷及疏水區(qū)段的組蛋白,，就像膠帶一樣能夠吸附很多物質,，包括各種雜蛋白、色譜填料,、目的病毒顆粒,。非特異吸附雜蛋白，會影響蛋白雜質（如HCP）等的去除,；吸附到色譜填料上,，會降低色譜分離純化效率；吸附到目的病毒顆粒時,，會影響目的產物的穩(wěn)定性,，從而降低目的產物的得率。因此,，從生產工藝層面來講,，一定要去除HCD，從而能夠簡化工藝,、提高目的產物的產量,。

監(jiān)管部門對HCD的殘留量有明確的規(guī)定。美國FDA發(fā)布的指導原則中指出生物制品HCD殘余限度為 100pg/劑,，對于大劑量生物制品如單克隆抗體,，根據其殘留DNA來源及給藥途徑，殘留量可放寬至 10ng/劑,。細胞基因藥物終產品的DNA殘留有兩種來源,，分別是宿主細胞DNA（HCD）和轉染用的質粒。質粒和HCD的存在形式不同,，去除效率也差別很大,。其中，質粒是裸露的DNA雙鏈,，帶強負電荷,，通過色譜純化主要是離子交換能夠很高效去除；HCD則是以核小體緊密折疊形成的染色質形式存在,，幾乎不以裸DNA形式存在,，所以很難去除。中鹽核酸酶的生產在符合ISO13485:2016體系基礎上,，增加了cGMP相應要求,。

在生物工藝中，核酸酶的主要作用是高效消化宿主細胞DNA（HCD）,，并將其分解成足夠小的片段,，以便在下游純化過程中去除。雖然大多數核酸酶可以在生理鹽條件下高效地將裸DNA降解成微小片段,，比如Benzonase和SANs都可以把dsDNA分解成小于8nt的寡核苷酸鏈,，但實際生產中的核酸污染情況更加復雜,。HCD通常以染色質形式存在，與細胞裂解碎片,、病毒顆粒等結合在一起,，影響核酸酶的識別及剪切,。因此,，HCD去除的關鍵在于——核酸酶如何在復雜的生產體系中識別并剪切HCD。中鹽核酸酶更適合細胞培養(yǎng)體系,，相比全能核酸酶,，酶用量減少到1/3-1/2，HCD去除效率更高,。河北等滲條件中鹽核酸酶70950

染色質的雙螺旋結構影響DNA的檢測與酶切處理,，而中鹽核酸酶降解染色質效率更高。河南M-SAN HQ中鹽核酸酶

此外,，文章作者對每個步驟的樣品進行納米顆粒分析（NTA）,，結果發(fā)現：澄清環(huán)節(jié)后，M-SAN HQ中鹽核酸酶和Benzonase處理組才出現比較明確的LV病毒顆粒峰,；TFF處理后,，回流液樣品的LV病毒顆粒峰更加尖銳，表明病毒顆粒分散度更好,、穩(wěn)定性更高,。回流液的NTA結果進一步表明,，M-SAN HQ中鹽核酸酶處理組只有一個病毒顆粒峰,，而Benzonase處理組的回流液中有三個峰。作者推測Benzonase處理組的病毒顆粒還有嚴重的病毒團聚現象,，而呈現多峰現象,。河南M-SAN HQ中鹽核酸酶

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