luciferin)的分子結(jié)構(gòu)如右圖所示：，在氧氣,、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應(yīng),，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，分子結(jié)構(gòu)如右圖所示,，并產(chǎn)生長發(fā)生光現(xiàn)象,。但是該底物熒光素以前大多依賴進口，產(chǎn)品價格昂貴,。而且由于該產(chǎn)品容易降解,、受潮影響使用效果。所以,，需要國產(chǎn)化的方式生產(chǎn),，一方面可以降低成本，一方面可以增強使用效果,。作者：科遠迪鏈接：zhuanlan./p/來源：知乎著作權(quán)歸作者所有,。商業(yè)轉(zhuǎn)載請聯(lián)系作者獲得授權(quán)，非商業(yè)轉(zhuǎn)載請注明出處,。D-luciferin,，potassiumsalt熒光素產(chǎn)品說明書發(fā)光原理哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Fireflyluciferase基因（由554個氨基酸構(gòu)成,，約50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶,，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當細胞分裂,、轉(zhuǎn)移,、分化時,熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達?；?、細胞和活題動物都可被熒光素酶基因標記,。將標記好的細胞接種到實驗動物體內(nèi)后,，當外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(D-luciferin，potassiumsalt，以下均簡稱熒光素),，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生長發(fā)生光現(xiàn)象。所發(fā)的光波長在540-600nm,。這種酶在ATP，氧存在的條件下,，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光。D-熒光素鉀鹽的合作平臺有哪些,？上海體外研究D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

    室溫培育30min后加入細胞孔板中,，置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng),。2)單克隆細胞篩選轉(zhuǎn)染24h后胰酶消化細胞并按1∶6比例接種到新6孔板中，同時加入實驗確定的濃度G418,，隨后每2d更換一次培養(yǎng)基并維持G418篩選直至單細胞抗性克隆的出現(xiàn),。分別挑選單一抗性克隆至96孔板,，待其逐漸增殖后轉(zhuǎn)入24孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。3)熒光素酶活性鑒定陽性克隆單一抗性克隆傳代至第五代時用LuciferaseAs-sayAystem檢測熒光素酶活性。檢測時,，各克隆按1×105個/孔接種到24孔板，24h后細胞裂解液裂解12000rpm,，4℃離心10min，收集裂解物,，取上清10μl加入96孔白板中,，向每孔加入50μl熒光素酶96microplateluminometer連續(xù)讀底物,，停留2s后,，取10s的熒光值（RLU）,，每個克隆設(shè)3個復(fù)孔,，保留RLU值高的細胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng),，再過5代后進行熒光素酶活性檢測,。保留RLU值維持較高的克隆直至第30代,，熒光素酶活性更高的幾個克隆MCF-7-luc即為陽性克隆.各不同數(shù)量細胞克隆的熒光值檢測7-luc陽性克隆細胞按細胞數(shù)將篩出的MCF-4×104,、2×104、1×104,、5000,、2500、1250,、625,、312和156分別接種到96孔黑板中，另外一組只有細胞,，一組只有培養(yǎng)基作對照,，設(shè)置2個復(fù)孔，常規(guī)培去上清并用PBS洗兩次,。宿遷熒光素酶編碼基因D-熒光素鉀鹽溶液怎么保存D-熒光素鉀鹽應(yīng)立即使用,，或分裝于-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融,。

    熒光素也就是FDAFDA可透過細胞膜并作為熒光素積蓄在活細胞內(nèi),。由于熒光素較BCECF或Calcein的親水性低，因此熒光素從細胞中滲漏的量也高,。FDA也可用于流式細胞儀,。熒光素的激發(fā)和發(fā)射波長分別為488nm和530nm。熒光素酶（英文名稱：Luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱,，其中更有代表性的是一種學(xué)名為Photinuspyralis的螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶,。在相應(yīng)化學(xué)反應(yīng)中，熒光的產(chǎn)生是來自于螢光素的氧化,，有些情況下反應(yīng)體系中也包括三磷酸腺苷（ATP）,。沒有熒光素酶的情況下,，螢光素與氧氣反應(yīng)的速率非常慢，而鈣離子的存在常?？梢赃M一步加速反應(yīng)（與肌肉收縮的情況相似）,。[1]熒光生成反應(yīng)通常分為以下兩步：螢光素+ATP→螢光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi螢光素化腺苷酸+O2→氧熒光素+AMP+光這一反應(yīng)非常節(jié)省能量，幾乎所有輸入反應(yīng)的能量都被轉(zhuǎn)化為光,。與之形成鮮明對比的是人類使用的白熾燈,，只有越10%的能量被轉(zhuǎn)化為光，剩余的能量都變?yōu)闊崮芏焕速M,。熒光素或熒光素酶不是特定的分子,，而是對于所有能夠產(chǎn)生熒光的底物和其對應(yīng)的酶的統(tǒng)稱，雖然它們各不相同,。不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不同的熒光素酶來催化不同的發(fā)光反應(yīng),。

    通過開發(fā)新的方法來改變螢火蟲螢光素酶檢測的信號動力學(xué)，例如Bright-Glo?,、Steady-Glo?和Dual-Glo?允許使用微孔板進行檢測,。而“加樣-讀數(shù)”的形式簡化了樣品處理，并實現(xiàn)了在非常高通量的應(yīng)用中使用報告基因檢測,。[1]隨著UltraGlo?螢光素酶的發(fā)展,，現(xiàn)在已經(jīng)實現(xiàn)了“加樣-讀數(shù)”的ATP檢測方法。ATP是細胞健康的重要指標,，這使得CellTiter-Glo?能有效測定細胞活力,，尤其是在高通量應(yīng)用中。該檢測原理還促進了其它ATP檢測平臺的誕生,，尤其是用于研究ATP酶（如激酶）的Kinase-Glo?（2004年）和ADP-Glo?（2009年）酶檢測系統(tǒng),。[1]2003Caspase-Glo?3/7檢測除了可以利用螢火蟲螢光素酶反應(yīng)測定樣品中螢光素酶或ATP的含量外，還可以檢測底物（luciferin）濃度的變化,。通過將luciferin與可被不同酶類識別并產(chǎn)生反應(yīng)的保護基團偶聯(lián),，能對這些酶進行靈敏的“加樣-讀數(shù)”檢測，如半胱天冬酶（caspase）和其它蛋白酶,。[1]2007One-Glo?螢光素酶檢測系統(tǒng)隨著對螢火蟲螢光素酶化學(xué)反應(yīng)的進一步了解以及Promega生物學(xué)家和化學(xué)家團隊的建立,，一種改進的luciferin面世,，能更好地用于典型的報告基因檢測應(yīng)用,。這種新的底物——fluoroluciferin。D-熒光素鉀鹽長期保存條件是-20℃干燥避光,。

    常見的熒光素酶有兩種,，分別是螢火蟲熒光素酶（fireflyluciferase，編碼基因是luc）和海腎熒光素酶（Renillaluciferase,，編碼基因是Rluc）,，前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它們共同的作用原理是在ATP和熒光素酶的催化作用下,，底物被氧化發(fā)光（不同底物光的顏色和波長不同）,，當?shù)孜镞^量時，產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性,。***成像技術(shù)（opticalinvivoimaging）目前主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù),，生物發(fā)光法是基于熒光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化學(xué)發(fā)光的原理，將體外能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株植入動物體內(nèi),，與后期注射入體內(nèi)的底物發(fā)生反應(yīng),，利用光學(xué)系統(tǒng)檢測光強度，間接反映出細胞數(shù)量的變化或細胞的定位,。這項技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域常用的有**或疾病動物模型的建立,，并可用于病毒學(xué)研究、siRNA研究,、干細胞研究,、蛋白質(zhì)相互作用研究等。以下主要介紹D-Luciferin（D熒光素）的分類：D-Luciferin：有三種,，分別是D-Luciferin,SodiumSalt/D熒光素鈉鹽,、D-Luciferin,PotassiumSalt/D-熒光素鉀鹽和D-LuciferinFirefly,freeacid/D-螢火蟲熒光素。D-熒光素鉀鹽母液保存條件是-20℃避光,。泰州熒光素鈉鹽D-熒光素鉀鹽發(fā)射波長

D-熒光素鉀鹽適用于哪些領(lǐng)域,？上海體外研究D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

    每孔加入100μl養(yǎng)24h后，Luciferin使其終濃度為150μg/ml,，PBS,，再加入D-立即用活題成像系統(tǒng)檢測，分析發(fā)光強度與細胞數(shù)之間的相關(guān)性,。4)細胞生長曲線繪制MCF7-luc細胞和作為對照取表達熒光素酶的MCF-7細胞,，接種于24孔板，接種密度為2×104/孔,。細胞接種后1～7d,，每天胰蛋白酶消化其中3孔細胞，用細胞計數(shù)儀測定細胞數(shù),。以細胞生長天數(shù)為橫坐標,，細胞數(shù)目為縱坐標，分別繪制兩種細胞生長曲線,。二．動物模型BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/cnu/nu裸鼠,，4～5周齡，體重（15±2）g,，雌雄各3只,。取對數(shù)生長期的MCF-7用PBS重懸為2．5×10/ml懸液,，每只裸鼠左右背側(cè)近腋部皮下接種100μl，共接種6只,。接種后第5d采用德國BERTHOLD公司的活題成像系統(tǒng)檢測信號強度,。以后每5d觀測一連續(xù)觀測30d。觀測前每只裸鼠戊巴比妥鈉麻醉（計量為：35mg/kg體重）,，按150mg/kg體重的量腹腔注射luciferin（invivograde）,，10min后，進行活題成像觀察皮下腫大的瘤的生長情況,，定量分析各時間點的熒光值,。繪制腫大的瘤皮下生長曲線.MCF-7-luc細胞裸鼠皮下移植瘤的病理形態(tài)學(xué)觀察MCF-7-luc細胞裸鼠皮下接種后25d，脫頸處死小鼠,，取腫大的瘤組織,，制成石蠟切片，切片厚度為3μm,。上海體外研究D-熒光素鉀鹽應(yīng)用

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