聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：PCR反應(yīng)的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性,，但令人腦袋不適的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生,。 污染原因：標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染,，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外,，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染,；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染,；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,，導致彼此間的污染。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣,、容器,、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。熱啟動聚合酶鏈式反應(yīng)：一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴增的技術(shù),。無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

基于聚合酶鏈反應(yīng)的遺傳(或脫氧核糖核酸)指紋圖譜協(xié)議的發(fā)展已在法醫(yī)學中得到較廣應(yīng)用：遺傳指紋以其辨別力的形式,，可以從世界上所有人群中獨特地區(qū)分任何一個人。微小的DNA樣本可以從犯罪現(xiàn)場,，和比較的從嫌疑人那里,，或者從DNA資料庫早期的證據(jù)或罪犯。這些測試的簡單版本通常用于在刑事調(diào)查中快速排除嫌疑人,。幾十年前的犯罪證據(jù)可以被檢驗,，確認或免責很初被定罪的人。脫氧核糖核酸指紋中較小的區(qū)別有助于親子鑒定,，在親子鑒定中,，一個人和他的近親相匹配?？梢詼y試未知人類遺骸的DNA,，并與可能的父母,、兄弟姐妹或兒童進行比較,。類似的測試可以用來確認被收養(yǎng)(或)孩子的親生父母。新生兒的實際生父也可以被確認(或排除),。無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用聚合酶鏈式反應(yīng)的引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,。

聚合酶鏈式反應(yīng)：反應(yīng)的控制：PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子,；鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高,，常用1.5mmol/L；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制,，20～200umol/L,；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L,；反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù),；變性溫度和時間 95℃，30s,；退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃,；延伸溫度和時間 72℃,，1min/kb(10kb內(nèi)）；Tm值=4(G+C) +2(A+T)；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次,。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量,。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量,。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的,。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后,，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”,。

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列,，其PCR擴增是不會成功的,。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊,，亮度更高,。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時,，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列,。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性,。需重新設(shè)計引物,。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,，dNTP濃度過高,，Mg2+濃度過高，退火溫度過低,，循環(huán)次數(shù)過多引起,。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶,。②減少dNTP的濃度,。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量,，減少循環(huán)次數(shù),。聚合酶鏈反應(yīng)非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝,，用于測序,、克隆和分析。

聚合酶鏈式反應(yīng)的步驟：標準的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA,；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合,，形成局部雙鏈,。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性很好）的作用下,，以dNTP為原料,，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈,。每一循環(huán)經(jīng)過變性,、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復制完成，因此可以改為兩步法,，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,。聚合酶鏈式反應(yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。上海特殊樣本Real-time PCR原理及步驟

聚合酶鏈式反應(yīng)中兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列,，尤其是避免3 ′端的互補重疊,。無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻,。引物特異性差,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。引物量過多,。減少反應(yīng)體系中引物的用量,。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,，而基因組DNA則應(yīng)<200ng,。外源DNA污染,。確保操作的潔凈,。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，頭,，工作臺污染,。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔,。條帶大小與理論不符：污染,。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤,。更換引物和模板,。基因亞型,。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究,。無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用